Wpływ podwyższonej aktywności kinazy Src był szeroko badany zarówno in vitro przy użyciu różnych ludzkich nowotworowych linii komórkowych (Budde et al., 1994; Rosen et al., 1986; Biscardi et al., 1998; Bjorge et al., 1996; Bolen et al. 1987a; Cartwright et al., 1989; Weber et al., 1992; Lutz et al., 1998) i in vivo z modelami murine (Biscardi et al., 1998; Irby et al., 1999; Muthuswamy et al., 1994; Staley et al., 1997; Wiener et al., 1999). Używając tych systemów, badacze przestudiowali sposoby aktywacji Src, efekty Src na inicjację i progresję guza oraz efekty inhibitorów kinazy tyrozynowej i antysensownych na zachowanie komórek. Badania te ilustrują złożoną sieć białek współdziałających z Src, które wpływają na liczne szlaki transdukcji sygnału.
Od wczesnych lat 80-tych, zwiększona aktywność kinazy Src została zgłoszona w różnych, pozornie niepowiązanych ludzkich nowotworach. Podwyższony poziom białka Src został znaleziony w wielu nowotworach, chociaż poziom białka może nie odzwierciedlać dokładnie specyficznej aktywności kinazy białkowej. Z tego powodu opracowano wiarygodne testy kinazowe wykorzystuj±ce egzogenne substraty w celu okre¶lenia specyficznej aktywno¶ci białka. Wyniki licznych badań odzwierciedlają wzrost specyficznej aktywności Src w ludzkich guzach oraz w liniach komórkowych pochodzących z tych guzów (Cartwright et al., 1989, 1990; Muthuswamy et al., 1994; Budde et al., 1994; Jacobs and Rubsamen, 1983; Mao et al., 1997; Masaki et al., 1998, 2000; Muthuswamy and Muller, 1994; Rosen et al., 1986; Verbeek et al., 1996).
Rak piersi
Aktywność kinazy Src, od 4-20-krotnie wyższa niż tkanek prawidłowych, została stwierdzona w ludzkich rakach sutka (Egan et al., 1999; Jacobs i Rubsamen, 1983; Muthuswamy i Muller, 1994; Muthuswamy i wsp., 1994; Ottenhoff-Kalff i wsp., 1992; Rosen i wsp., 1986; Verbeek i wsp., 1996). Podobnie, linie komórkowe wywodzące się z tych guzów wykazują do 30-krotnego wzrostu aktywności Src. Ostatnie dane sugeruj±, że czę¶ć tej aktywno¶ci można przypisać działaniu fosfataz skutkuj±cych depfosforylacj± Tyr 530 (Egan i in., 1999). Rosen et al. (1986) odnotowali podwyższoną aktywność kinazy Src w guzach piersi przy względnie normalnym poziomie białka Src w porównaniu do normalnej tkanki. Z drugiej strony, Verbeek i wsp. (1996) przedstawili immunohistochemiczne dowody na to, że 4-30-krotnemu wzrostowi aktywności Src towarzyszył wzrost poziomu białka Src. Ottenhoff-Kalff i wsp. (1992) stwierdzili, że 72/72 raki piersi wykazywały wzrost aktywności kinazy tyrozynowej, z czego 70% przypisywano c-Src lub kinazom podobnym do Src.
Aktywacja Src w guzach sutka została dobrze zbadana u myszy transgenicznych. Myszy wyrażające wirusowy polioma środkowy antygen T pod kontrolą promotora MMTV produkują wysoce metastatyczne guzy sutka z podwyższoną aktywnością kinazy c-Src (Guy et al., 1994). Muthuswamy et al. (1994) odkryli, że myszy z nadekspresją onkogenu neu również rozwijają guzy sutka z 6-8-krotnie wyższą aktywnością kinazy c-Src niż przylegająca tkanka prawidłowa. Są to dwa przykłady aktywowanej Src, jeden przykład wirusowego białka wiążącego i aktywującego Src, powodującego guzy, a drugi przykład receptorowej kinazy tyrozynowej powodującej aktywację Src i późniejsze guzy sutka. Eksperymenty na nagich myszach (Biscardi et al., 1998) z liniami komórkowymi raka piersi nadekspresyjnymi zarówno c-Src jak i HER1 (MDA-MB-468 i MDA-MB-231) w porównaniu z liniami komórkowymi nadekspresyjnymi tylko c-Src (MCF7 i ZR-75-1) ujawniły zwiększoną tumorogenność u myszy, którym wstrzyknięto linie MDA. To wspiera hipotezę, że aktywacja Src może być pośredniczona przez interakcje HER1.
Rak jelita grubego
Proto-onkogen c-src był często implikowany w inicjacji i progresji ludzkiego raka jelita grubego, oraz w powstających przerzutach (Bolen et al., 1987a; Cartwright et al., 1989, 1990, 1994; Talamonti et al., 1991; Termuhlen et al., 1993; Weber et al., 1992). Aktywność Src jest zwiększona 5-8-krotnie w większości guzów jelita grubego. To podwyższenie aktywności Src, i związanej z nią aktywności Yes, jest wczesnym zjawiskiem, występującym nawet w tkankach przednowotworowych (Cartwright i in., 1994) i polipach gruczolakowatych (Cartwright i in., 1990; Pena i in., 1995). Aktywność jest najwyraźniej wysoka w polipach złośliwych oraz w łagodnych polipach zawierających zmiany kosmkowe lub ciężką dysplazję, które są najbardziej zagrożone rozwojem raka. Stwierdzono również, że aktywność Src jest podwyższona w łagodnie dysplastycznym nabłonku (6-10-krotnie) w bezpośrednim porównaniu z sąsiednim niedysplastycznym nabłonkiem we wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego, zwiększając się jeszcze bardziej w tkance poważnie dysplastycznej, która jest najbardziej zagrożona rozwojem raka (Cartwright i in., 1994).
Rola Src w progresji nowotworu jest przejmująco zilustrowana przez obserwacje, że aktywność Src wzrasta wraz z progresją nowotworów jelita grubego, będąc wyższa w guzach pierwotnych niż w polipach i wyższa jeszcze w przerzutowych zmianach wątroby (Talamonti i in., 1991). Trend ten jest odzwierciedlony w sześciu sparowanych próbkach synchronicznych zmian pierwotnych i przerzutowych pochodzących od tego samego pacjenta. Podczas gdy poziomy białka Src różnią się znacznie u poszczególnych pacjentów, poziom aktywności wzrasta w przerzutach do wątroby w porównaniu z synchronicznymi guzami pierwotnymi – ponad dwukrotnie bardziej niż wzrost poziomu białka Src. Dalsze różnice występują w poziomach aktywowanego Src obserwowanych w przerzutach jelita grubego do miejsc pozawątrobowych (Termuhlen et al., 1993). Ponadto, przerzuty jelita grubego do jamy brzusznej, miednicy i klatki piersiowej wykazywały znaczący wzrost aktywności w porównaniu z przerzutami do wątroby. Dane te nasuwają pytanie, czy miejsce przerzutu wpływa na specyficzną aktywność Src, czy też specyficzna aktywność Src wpływa na miejsce zmiany przerzutowej.
Wpływ Src w raku jelita grubego został również zbadany poprzez badanie poziomów Src w guzach jelita grubego w różnych stanach zróżnicowania. Uzyskane wyniki są interesujące, ale nie zawsze intuicyjne. Weber et al. (1992) podali, że najwyższe poziomy aktywności Src w ludzkich guzach okrężnicy wystąpiły w guzach umiarkowanie do dobrze zróżnicowanych, a poziomy wydają się dość normalne w słabo zróżnicowanych guzach okrężnicy, co zostało poparte przez różne linie komórek nowotworowych. Park et al. (1993) oraz Park i Cartwright (1995) odnotowali wzrost Src, jak również kinazy z rodziny Src, Tak, zarówno w liniach komórkowych okrężnicy, jak i w pierwotnych nowotworach okrężnicy, ale badania te wykazały wyciszenie kinaz Src we w pełni zróżnicowanych komórkach. Wyniki te, na pierwszy rzut oka, są trudne do zinterpretowania wiedząc, że guzy słabo zróżnicowane są biologicznie bardziej agresywne niż guzy dobrze zróżnicowane. Większość przerzutów do wątroby jelita grubego, jednakże, jest w rzeczywistości dobrze do średnio zróżnicowana i ta przewaga może wyjaśniać obserwowane wyniki.
Rola Src w raku jelita grubego została ostatnio zbadana przy użyciu modelu nagiej myszy wstrzykiwanej z różnymi liniami komórkowymi raka jelita grubego (Irby i wsp., 1997; Staley i wsp., 1997). Staley i wsp. (1997) transfekowali linię komórkową raka okrężnicy HT 29 wektorem antysensownym zaprojektowanym w celu zmniejszenia ekspresji c-Src, ale nie ekspresji c-Yes. Po wstrzyknięciu gołym myszom, komórki te tworzyły wolno rosnące guzy z szybkością proliferacji opóźnioną bardziej niż zmniejszona szybkość proliferacji komórek rodzicielskich hodowanych w hodowli. W przeciwieństwie do nich, komórki trwale transfekowane wektorem sensownym nie wykazywały różnicy w proliferacji w hodowli ani u myszy nagich w stosunku do komórek HT 29 typu dzikiego. W drugim badaniu próbującym określić fenotypowe skutki nadekspresji c-Src typu dzikiego na ludzkich komórkach raka jelita grubego, komórki raka jelita grubego KM12C transfekowane c-Src wyrażające do 10 razy więcej c-Src niż komórki typu dzikiego były wstrzykiwane podskórnie i śródkostnie myszom nagim (Irby et al., 1997). Komórki z wyższym poziomem ekspresji c-Src tworzyły szybciej rosn±ce guzy niż komórki typu dzikiego, ale nie tworzyły przerzutów do w±troby. Co ciekawe, komórki transfekowane i typu dzikiego hodowane in vitro wykazywały podobne tempo proliferacji. Te dwa badania wskazuj±, że po pierwsze, poziom Src i jego aktywno¶ć zmienia tempo wzrostu guza proporcjonalnie in vivo, a po drugie, tempo wzrostu in vitro niekoniecznie odzwierciedla tempo wzrostu komórek in vivo. Sugeruje to, że na wzrost komórek nowotworowych duży wpływ ma mikrośrodowisko, i być może wskazuje na potencjał aktywności Src w komórce nowotworowej do wpływania na ekspresję białek promujących nowotwory przez gospodarza. Badania te pokazują również, że nadekspresja samego c-Src typu dzikiego, podczas gdy wyraźnie wpływa na wzrost guza in vivo, może być niewystarczająca do wywołania fenotypu metastatycznego.
Rak trzustki
Aktywność Src była ostatnio badana w raku trzustki. Lutz et al. (1998) badali raka przewodowego trzustki, jak również linie komórkowe trzustki pod względem podwyższonego poziomu białka Src i aktywności kinazy. Poziom białka Src był podwyższony w 13/13 raków trzustki i w 14/17 pancreatic cell lines. Aktywność kinazy była wykrywalna tylko w komórkach nowotworowych i aktywność ta nie korelowała ani z poziomem białka c-Src ani Csk. Dalsze badania z użyciem inhibitora kinazy tyrozynowej, herbimycyny A, wykazały, że aktywność Src była instrumentalna w promowaniu wzrostu komórek nowotworowych trzustki. Jedna z metod, dzięki której Src zwiększa wzrost guza trzustki została zasugerowana przez Flossmann-Kast et al. (1998). Grupa ta stwierdziła, że Src powoduje wzrost liczby cząsteczek receptora insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF-R) na komórkę, zwiększając w ten sposób wzrost zależny od IGF. W innym badaniu, opartym na szczurzym modelu karcynogenezy trzustki (Visser i in., 1996), wzrost aktywności kinazy Src korelował dodatnio z liczbą zmian obecnych w trzustce. Temu wzrostowi aktywności towarzyszyła relokalizacja białka c-Src do jądra, co sugeruje rolę Src w regulacji genów.
Różne nowotwory
Podwyższony poziom białka Src i/lub aktywność kinazy odnotowano w rakach płuc (50-80%) (Mazurenko i in., 1992), nerwowych (23/27 neuroblastomas, 3/3 retinoblastomas) (Bjelfman i in., 1990; Bolen i wsp., 1985), raka jajnika (Budde i wsp., 1994; Wiener i wsp., 1999), przełyku (3-4-krotny wzrost aktywności w przełyku Barretta i 6-krotny w gruczolakorakach) (Kumble i wsp., 1997) i żołądka (Takeshima i wsp., 1991), a także czerniaka (Bjorge i wsp., 1996) i mięsaka Kaposiego (Munshi i wsp., 2000). Podobnie wykazano, że kinazy rodziny Src: Lck, Lyn i Fgr są aktywowane podczas wzrostu komórek białaczkowych (Abts et al., 1991) (Dai et al., 1998; Danhauser-Riedl et al., 1996; Roginskaya et al., 1999).
.