Ekspresja i oczyszczanie GyrB i GyrA
Sekwencję kodującą pełną długość E. coli GyrA (2-875) wprowadzono do zmodyfikowanego pET28b zawierającego N-końcowy znacznik 10-His i C-końcowy znacznik Twin-strep. Nadekspresję przeprowadzono w E. coli BL21 (DE3) pRARE2 w podłożu LB zawierającym 50 µg/mL kanamycyny i 35 µg/mL chloramfenikolu. Komórki indukowano 0,35 mM IPTG po osiągnięciu OD600 0,85, a białko ulegało ekspresji w temperaturze 37 °C przez 4 h. Komórki zbierano i zawieszano w buforze lizującym (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, 10% v/v glicerol, pH 8,0) i lizowano trzema cyklami wysokociśnieniowego rozbijania przy użyciu EmulsiFlex-C3 pod ciśnieniem 1500 barów. Białko GyrA oczyszczano metodą chromatografii powinowactwa do niklu na ręcznie pakowanej kolumnie XK 26/20 (Pharmacia) z żywicą Chelating Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) związaną z jonami Ni2+. Elucję przeprowadzano za pomocą buforu lizującego zawierającego 250 mM imidazolu o pH 8,0, a eluowane białka bezpośrednio przyłączano na 10 ml Streptavidin Sepharose (GE Healthcare). Białka były intensywnie przemywane buforem Strep (20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glicerol, pH 8.0) i eluowane buforem Strep zawierającym 3 mM Desthiobiotin (Sigma-Aldrich). Zarówno tag 10-His, jak i tag Twin-strep były następnie rozszczepiane przez proteazę PreScission (P3C) i wirusa Tobacco Etch Virus (TEV) (stosunek masowy 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) przez noc w 4 °C. GyrA był następnie dalej oczyszczany na etapie chromatografii anionowymiennej przy użyciu kolumny HiTrap Q HP (GE Healthcare). Białko było eluowane liniowym gradientem 20 objętości kolumny z buforem B (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glicerol, pH 8.0). Frakcje zawierające GyrA były łączone i ładowane na kolumnę do chromatografii Superdex S200 16/60 z wykluczeniem rozmiaru (GE Healthcare) przy użyciu 20 mM Hepes, 50 mM NaGlu, 50 mM KAc, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 10% v/v glicerolu, pH 8.0. 37 mg GyrA uzyskano z 3 L hodowli. Sekwencja kodująca GyrB (2-804) została wprowadzona do tak samo zmodyfikowanego pET28b. Nadekspresję przeprowadzono w E. coli BL21 (DE3) pRARE2 w podłożu LB zawierającym 50 µg/mL kanamycyny i 35 µg/mL chloramfenikolu. Komórki indukowano 0,35 mM IPTG po osiągnięciu OD600 0,85, a białko ulegało ekspresji w 18 °C przez 18 h. Procedura oczyszczania GyrB jest taka sama jak opisana powyżej dla GyrA. 10 mg GyrB uzyskano z 3 L hodowli.
Pełna rekonstytucja gyrazy DNA
E. coli GyrA i GyrB zmieszano w stosunku równomolowym, aby umożliwić pełną rekonstytucję gyrazy DNA. Kompleks był dalej oczyszczany na kolumnie chromatograficznej Superdex S200 16/60 size-exclusion (GE Healthcare) przy użyciu buforu cryo-EM (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0,5 mM TCEP, pH 8,0) (Fig. 1 i Supplementary Fig. 1).
Przygotowanie kwasów nukleinowych
Podwójnienicowany dupleks DNA o długości 180 bp odtworzono przy użyciu 2 fosforylowanych asymetrycznych syntetycznych oligonukleotydów12 uzyskanych od firmy Sigma-Aldrich (Tabela uzupełniająca 1). W skrócie, kwasy nukleinowe rozpuszczono w wodzie pozbawionej DNAse w stężeniu 1 mM. Aby utworzyć dwuniciowy DNA, każde oligo mieszano w stosunku molowym 1:1, annektowano przez inkubację w 95 °C przez 2 min, a następnie zmniejszano temperaturę o 1 °C co 1 min, aż do osiągnięcia 20 °C. Zanegowany podwójnie skoniugowany dupleks DNA był następnie wymieniany buforowo w Hepes 20 mM pH 8,0 za pomocą kolumny BioSpin 6 (BioRad).
Tworzenie kompleksów dla cryo-EM
Oczyszczona gyraza DNA była mieszana z 180 bp dsDNA w stosunku molowym 1:1 z końcowym stężeniem białka i DNA 32 µM. Mieszaninę inkubowano przez 10 min w temperaturze 37 °C. Gepotydacynę (GSK2140944, zakupiono w MedChemExpress) zawieszoną w stężeniu 10 mM w 100% DMSO dodawano do końcowego stężenia 170 µM (1,7% DMSO). Mieszaninę inkubowano przez 10 min w temp. 37 °C. Do kompleksu dodawano AMP-PNP (Sigma) w końcowym stężeniu 340 µM. W pełni zrekonstytuowany kompleks inkubowano dalej 30 min w temp. 30 °C. Na koniec do kompleksu dodawano 8 mM CHAPSO (Sigma-Aldrich). Próbkę odwirowywano przez 2 h przy 16 000 × g w celu usunięcia potencjalnych agregatów.
Przygotowanie siatki kryo-EM
Siatki miedziane Quantifoil R-1.2/1.3 o oczkach 300 były ładowane jarzeniowo przez 20 s przed nałożeniem 4 µl kompleksu. Po 30 s inkubacji, siatki zostały zamrożone w ciekłym etanie przy użyciu urządzenia Vitrobot mark IV (FEI) przy 95% wilgotności komory w temperaturze 10 °C.
Mikroskopia elektronowa
Obrazy krioEM wykonano w mikroskopie Titan Krios pracującym przy napięciu 300 kV (FEI) wyposażonym w kamerę elektronową K2 Summit (Gatan), filtr energetyczny GIF Quantum (Gatan) pracujący w trybie zerowej straty energii o szerokości szczeliny 20 e-V, płytkę fazową Volty (FEI) oraz korektor CS (FEI). Obrazy były rejestrowane w trybie nanoprobówki EFTEM przy użyciu Serial EM53 w trybie zliczania superrozdzielczości przy nominalnym powiększeniu 130 000x z rozmiarem piksela superrozdzielczości 0,44 Å i stałym ogniskiem docelowym -500 nm (Supplementary Fig. 2c). VPP był przesuwany do nowej pozycji co 100 min (Supplementary Fig. 2b). Zebrano cztery zestawy danych z szybkością dawki 6 do 8 e-/piksel/s (wielkość piksela 0.88 Å na próbce) na detektorze. Obrazy były rejestrowane przy dawce całkowitej 50 e-/Å2, czasie ekspozycji od 7 do 10 s i podramkach 0,2 do 0,25 s (35 do 50 klatek ogółem). W sumie zarejestrowano 11 833 filmów po zebraniu danych z 4 zestawów danych.
Obróbka danych
Obróbka danych każdego zestawu danych została wykonana oddzielnie zgodnie z tą samą procedurą aż do rafinacji 3D, kiedy cząstki zostały połączone. Superrozdzielcze podramki poddane frakcjonowaniu dawki zostały skorygowane wzmocnieniem za pomocą IMOD54 i dwukrotnie podzielone na kategorie przez Fourier-cropping, skorygowane dryftem i ważone dawką za pomocą MotionCor255 , dając zsumowane obrazy o rozmiarze piksela 0.88 Å. Funkcja transferu kontrastu skorygowanych mikrografów została oszacowana przy użyciu GCTF v1.0656. Pierścienie Thona zostały ręcznie sprawdzone pod kątem astygmatyzmu, a mikrografy z mierzoną rozdzielczością gorszą niż 4 Å zostały odrzucone dając 8,701 pozostałych mikrografów. Cząstki były automatycznie wybierane za pomocą bezreferencyjnego protokołu Gaussian blob picking w programie RELION229,30. Łącznie z 4 zestawów danych wybrano 1 572 962 cząstek. Cztery razy posortowane cząstki z każdego zbioru danych były oddzielnie poddawane dwóm rundom klasyfikacji 2D w programie RELION2 w celu usunięcia cząstek śmieci i zanieczyszczeń, w wyniku czego otrzymano łącznie 479 667 cząstek do dalszego przetwarzania. Cząstki z czterech zbiorów danych zostały połączone w jeden unikalny zbiór danych, po czym dokonano ponownej ekstrakcji z centrowaniem w formacie 3 × 3 binowane. Następnie przeprowadzono ostatnią rundę klasyfikacji 2D, uzyskując ostateczny stos cząstek składający się z 338 616 cząstek. Kolejny stos cząstek został poddany jednej rundzie klasyfikacji 3D ab-initio w cryoSPARC31. Po odrzuceniu modeli o niskiej jakości, pozostały model ab-initio dał ostateczny zbiór danych 191 456 cząstek, z progiem prawdopodobieństwa klasy 0,9 (Supplementary Fig. 2a). Model ab-initio został przefiltrowany dolnoprzepustowo do 30 Å i użyty jako referencja do homogenicznego rafinowania w cryoSPARC, w wyniku którego otrzymano mapę 5.4 Å. Wyrafinowane współrzędne cząstek zostały następnie użyte do lokalnej estymacji CTF przy użyciu GCTF v1.06, po czym nastąpiła ponowna ekstrakcja cząstek 2 × 2 binowanych z centrowaniem. Ten nowy stos cząstek został poddany automatycznemu rafinowaniu 3D w programie RELION2 przy użyciu modelu ab-initio filtrowanego dolnoprzepustowo na 30 Å, dając mapę o globalnej rozdzielczości 5.0 Å (Supplementary Fig. 3). Rozdzielczość lokalna wykazała zakres rozdzielczości od 4,0 Å w rdzeniu wiążącym/rozbijającym DNA do 9,0 Å w domenie ATPazy i β-koła GyrA oplatającego DNA, co wskazuje na dużą elastyczność tych dwóch modułów. Aby uzyskać ostateczną rekonstrukcję pełnego kompleksu z dobrze zdefiniowanymi gęstościami dla każdej domeny, przeprowadziliśmy klasyfikację 3D bez wyrównywania, uzyskując kilka różnych klas. Cząstki z trzech klas zostały połączone (94 633 cząstki). Następnie stos cząstek 1 × 1 był rafinowany w RELION2 bez maski, aż do późnych iteracji rafinacji, gdzie zastosowano miękką maskę w celu poprawy rozdzielczości. Postprocessing mapy dał rekonstrukcję całego kompleksu w rozdzielczości 6,6 Å (Supplementary Fig. 3).
Kombinacja różnych lokalnych podejść została użyta do identyfikacji różnych konformacji i poprawy lokalnej rozdzielczości każdej domeny. Ponieważ domena ATPazy była zbyt mała dla zogniskowanej rafinacji 3D, najpierw przeprowadziliśmy zogniskowaną klasyfikację 3D domeny ATPazy z miękką maską i bez wyrównywania w RELION2. Wybrano jedną klasę 58 329 cząsteczek o dobrze zdefiniowanej gęstości domeny ATPazy, a następnie przeprowadzono ponowną ekstrakcję cząsteczek 1 × 1-binowanych, uzyskując cząsteczki o rozmiarze piksela 0,88 Å/piksel. Aby ułatwić dokładne wyrównanie cząsteczek, klasa ta została poddana dalszej obróbce w RELION2 z użyciem miękkiej maski wokół domeny ATPazy i domeny wiążącej/usuwającej DNA, dając mapę o globalnej rozdzielczości 5,9 Å (ATPase-Core) (Supplementary Fig. 3).
Po drugie, przeprowadziliśmy ukierunkowaną klasyfikację 3D koła β GyrA z miękką maską i bez wyrównywania w RELION2. Wybrano jedną klasę 45 040 cząstek o dobrze zdefiniowanej gęstości koła β GyrA, po czym dokonano ponownej ekstrakcji cząstek 1 × 1-binowanych, uzyskując cząstki o rozmiarze piksela 0.88 Å/piksel. Klasę tę poddano dalszej rafinacji w RELION2 z użyciem miękkiej maski wokół koła β i domeny wiązania/oczyszczania DNA, uzyskując mapę o rozdzielczości 6,3 Å (CTD-Core) (Supplementary Fig. 3).
Na koniec przeprowadzono ukierunkowaną auto-rafinację 3D w RELION2 z użyciem miękkiej maski wokół domeny wiązania/oczyszczania DNA. W wyniku postprocessingu mapy otrzymano rekonstrukcję domeny wiążącej/cleavage DNA w rozdzielczości 4,3 Å. Następnie przeprowadzono ukierunkowaną klasyfikację 3D domeny wiążącej/cleavage DNA. Dwie z klas wykazały lepszą dokładność kątową i wyraźne konformacje zamknięte (60 548 cząsteczek) i przedotwarte (53 655 cząsteczek) domeny wiążącej/cleavage DNA. Te dwie klasy były dalej udoskonalane w RELION2 przez ukierunkowaną rafinację 3D z symetrią C2 przy użyciu cząstek 1 × 1 binowanych i dały rekonstrukcje o globalnej rozdzielczości odpowiednio 4.0 i 4.6 Å po post-processingu (Supplementary Fig. 3). Zamknięta domena wiązania/rozpadu DNA została poddana dalszej rafinacji 3D przy użyciu miękkiej maski, która wyklucza nieuporządkowaną wstawkę TOPRIM, dając wysokiej jakości mapę o rozdzielczości 4.0 Å (Supplementary Fig. 3).
Wszystkie raportowane rozdzielczości oparte są na złotym standardzie kryterium FSC-0.14357 , a krzywe FSC zostały skorygowane o efekty konwolucji miękkiej maski przy użyciu wysokorozdzielczej substytucji szumów58 w RELION2, jak również w cryoSPARC (Supplementary Fig. 4a). Wszystkie rekonstrukcje zostały wyostrzone przez zastosowanie ujemnego współczynnika B, który został oszacowany przy użyciu automatycznych procedur59. Lokalna rozdzielczość map została obliczona przy użyciu programu Blocres60 (Supplementary Fig. 4c). Mapy krio-EM całego kompleksu, rdzenia ATPazy, rdzenia CTD i domeny wiążącej/usuwającej DNA w stanie zamkniętym (z i bez wstawki TOPRIM) oraz w stanie przed otwarciem zostały zdeponowane w EM Data Bank pod numerami akcesyjnymi odpowiednio EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909, EMD-4912.
Budowa modelu i rafinacja
Rekonstrukcja EM domeny wiążącej/rozbijającej DNA bez wstawki TOPRIM rozwiązana na poziomie 4.0 Å była najlepszej jakości. Prawie wszystkie łańcuchy boczne mogły być widoczne, a gęstość Gepotidacin była wyraźnie widoczna. Mapa ta została wykorzystana do udoskonalenia struktury krystalicznej domeny wiążącej i rozbijającej DNA gyrazy DNA E. coli17. Dimeryczny model atomowy domeny wiążącej/rozbijającej DNA został wygenerowany przy użyciu PDB 3NUH w PyMol (Schrodinger L.L.C.). Kolejny model atomowy został pozbawiony aminokwasów należących do wstawki TOPRIM, wszystkich jonów i cząsteczek wody, z wszystkimi zajętościami ustawionymi na 1 i współczynnikami B ustawionymi na 50. W pierwszej kolejności model atomowy został dopasowany sztywnym ciałem do przefiltrowanej i wyostrzonej mapy za pomocą programu Chimera61. Pierwsza runda rafinacji w przestrzeni rzeczywistej w programie PHENIX62 została przeprowadzona przy użyciu lokalnego dopasowania w przestrzeni rzeczywistej i globalnej minimalizacji gradientowej. Następnie, 20 kwasów nukleinowych ze struktury gyrazy DNA S. aureus41 (PDB 5IWM) zostało skopiowanych i dopasowanych do naszego modelu atomowego. Sekwencja DNA została zmodyfikowana zgodnie z DNA użytym w naszej strukturze. Brakujące reszty białkowe i kwasy nukleinowe zostały ręcznie wbudowane w programie COOT63. Model atomowy i słownik ograniczeń gepotydacyny (GSK-2140944) zostały wygenerowane za pomocą serwera Grade (http://grade.globalphasing.org). Gepotidacyna została następnie ręcznie wpasowana w pustą gęstość elektronową w COOT, a następnie zduplikowana. Oba duplikaty zostały ustawione na 0,5 obłożenia. Przeprowadzono kilka rund rafinacji w przestrzeni rzeczywistej w programie PHENIX z zastosowaniem ograniczeń dla struktury drugorzędowej, rotamerów, Ramachandrana i symetrii niekrystalograficznej, po których zawsze następowała ręczna kontrola w COOT, aż do uzyskania zbieżnego modelu. W końcu, współczynniki B były rafinowane przez ostatnią rundę rafinacji w przestrzeni rzeczywistej w programie PHENIX przy użyciu tych samych ustawień jak poprzednio. Po zakończeniu rafinacji do modelu atomowego zostały dodane współrzędne atomowe wstawki TOPRIM. W rekonstrukcjach EM zawierających gęstość wstawki w stanach zamkniętym i przedotwartym została ona poddana dalszej rafinacji przy użyciu tej samej procedury. Przeprowadzono walidację krzyżową half-map, aby określić 1.5 jako najlepszą wagę rafinacji w PHENIX, pozwalającą na redukcję kolizji atomów i zapobiegającą przepasowaniu modelu (Supplementary Fig. 4e). Wszystkie kroki rafinacji zostały wykonane przy użyciu granicy rozdzielczości rekonstrukcji zgodnie ze złotym standardem kryterium FSC-0.14357. Parametry rafinacji, statystyki modelu i wyniki walidacji są podsumowane w Tabeli 2. Modele atomowe domeny wiążącej/usuwającej DNA E. coli w konformacjach zamkniętych (z insercją i bez insercji) i przed otwarciem zostały zdeponowane w Protein Data Bank pod numerami akcesyjnymi odpowiednio 6RKU, 6RKS, 6RKV.
Do budowy modelu atomowego kompleksu ogólnego gyrazy DNA użyliśmy kombinacji różnych rekonstrukcji EM. Struktura ATPase-Core rozwiązana na poziomie 5.9 Å została użyta do dopasowania w Chimerze struktury krystalicznej domeny ATPazy w kompleksie z ADPNP32 (PDB 1EI1) oraz domeny wiążącej/oczyszczającej DNA w konformacji zamkniętej. Jakość gęstości elektronowej pozwoliła na wbudowanie w COOT brakujących reszt linkera pomiędzy domeną ATPazy a domeną wiążącą/cleavage DNA. Struktura CTD-Core rozwiązana na poziomie 6,3 Å została wykorzystana do dokładnego dopasowania struktury krystalicznej β-pinwheel10 w programie Chimera. 10 brakujących aminokwasów (564-574) po GyrA-box zostało dodanych przy użyciu serwera modelującego Phyre264. Jakość gęstości elektronowej pozwoliła na wbudowanie w COOT brakujących kwasów nukleinowych wokół koła β, jak również 10 aminokwasów łączących ostatnie reszty GyrA z kołem β. Na podstawie przewidywania struktury drugorzędowej, część linkera została zbudowana jako helisa alfa (Rys. 3). Kolejny model atomowy zawierający domenę ATPazy, domenę wiążącą/usuwającą DNA oraz jedno koło β został dopasowany sztywnym ciałem do ogólnej struktury kompleksu rozwiązanej na poziomie 6,6 Å za pomocą programu Chimera. Następnie, kopia pierwszego koła β została dopasowana do gęstości drugiego koła β w programie COOT. Brakujące kwasy nukleinowe wokół drugiego koła β, jak również brakujące 10 reszt linkera zostały ręcznie wbudowane w COOT. Powstały model atomowy został pozbawiony wszystkich jonów i cząsteczek wody, przy czym wszystkie miejsca zostały ustawione na 1, a współczynniki B na 50. Na koniec, w programie PHENIX przeprowadzono rafinację modelu atomowego w przestrzeni rzeczywistej względem struktury kompleksu, stosując rafinację minimalizacyjną typu rigid-body i global gradient-driven. Granica rozdzielczości dla rafinacji została ustalona zgodnie ze złotym standardem kryterium FSC-0.14357. Przeprowadzono również walidację krzyżową half-map (Supplementary Fig. 4e). Parametry rafinacji, statystyki modelu i wyniki walidacji są podsumowane w Tabeli 2. Model atomowy struktury ogólnej został zdeponowany w Protein Data Bank pod numerem akcesyjnym 6RKW. Wszystkie ryciny zostały stworzone przy użyciu programów Chimera61, ChimeraX65 i PyMol (Schrodinger L.L.C.).
Oczyszczanie E. coli GyrB R286K, R286Q, i E264A
Zmodyfikowany pET28b użyty do nadekspresji dzikiego typu E. coli GyrB został zmutowany przez mutagenezę ukierunkowaną miejscowo przy użyciu zestawu QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis (Agilent) w celu wygenerowania trzech plazmidów niosących mutacje R286K, R286Q, lub E264A (Tabela Uzupełniająca 4). Procedury nadekspresji i oczyszczania dla tych trzech mutantów są identyczne jak dla GyrB typu dzikiego opisane powyżej w sekcji Metody.
T. thermophilus GyrB K284R, K284Q oczyszczanie
Zmodyfikowany pET28b użyty dla typu dzikiego T. thermophilus GyrB nadekspresji12 został zmutowany przez mutagenezę ukierunkowaną miejscowo przy użyciu zestawu QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis (Agilent) w celu wygenerowania dwóch plazmidów niosących mutacje K284R lub K284Q (Tabela Uzupełniająca 4). Procedury nadekspresji i oczyszczania dla tych dwóch mutantów są identyczne jak dla E. coli dzikiego typu GyrB opisanego powyżej w sekcji Metody.
Test superzwijania DNA
Wzrastające stężenie gyrazy DNA (GyrA2B2) inkubowano w temperaturze 37 °C z 6 nM zrelaksowanego plazmidu pUC19 w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 20 mM Tris-octan pH 7,9, 100 mM octan potasu, 10 mM octan magnezu, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 100 µg/ml BSA. Po 30 min reakcje zatrzymywano przez dodanie SDS 1%. Elektroforeza w żelu agarozowym została użyta do monitorowania konwersji zrelaksowanego pUC19 do formy superzwiniętej. Próbki prowadzono na 0,8% żelu agarozowym, 1X Tris Borate EDTA buffer (TBE), przy 6 V/cm przez 180 min w temperaturze pokojowej. Żele agarozowe barwiono bromkiem etydyny 0,5 mg/ml w 1X TBE przez 15 min, a następnie przez 5 min odbarwiano w wodzie. Topoizomery DNA ujawniano przy użyciu aparatu Typhoon (GE Healthcare).
Atest aktywnościATPazy
HydrolizaATP jest mierzona poprzez śledzenie utleniania NADH mediowanego przez kinazę pirogronianową (PK) i dehydrogenazę mleczanową (LDH). Absorbancję monitorowano przy długości fali 340 nm przez 600 s w temperaturze 37 °C za pomocą spektrofotometru Shimadzu 1700. Reakcje rejestrowano w triplikatach z 50-100 nM GyrA2B2 i 16 nM liniowego DNA (pCR-blunt) w 500 µl buforu zawierającego 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM octanu potasu, 8 mM octanu magnezu, 7 mM BME, 100 µg/mg BSA, 4U/5U mieszaniny PK/LDH, 2 mM PEP i 0.2 mM NADH.
Multiple alignment and evolutionary conservation of residues
Sekwencje białka ATPazy/Transduktora GyrB z 30 gatunków (kody Uniprot: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens; Q83FD5_COXBU, Coxiella burnetii; GYRB_ECOLI, Escherichia coli; GYRB_NEIGO, Neisseria gonorrhoeae; GYRB_SALTY, Salmonella typhimurium; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa, Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile; GYRB_RICFE, Rickettsia felis; Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis; GYRB_BORBU; Borrelia burgdorferi; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis, GYRB_THEMA, Thermotoga maritima; GYRB_THET8, Thermus thermophilus; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) zostały wyrównane przy użyciu serwera Clustal Omega (EMBL-EBI). Kolejne wyrównanie posłużyło do naniesienia ewolucyjnej ochrony aminokwasów na strukturę ATPazy/transduktora (PDB ID 1EI1) przy użyciu serwera ConSurf (http://consurf.tau.ac.il). Drzewo filogenetyczne zostało wygenerowane metodą neighbour-joining przy użyciu wielokrotnego wyrównania w Clustal Omega.
Podsumowanie
Dalsze informacje na temat projektu badań są dostępne w Nature Research Reporting Summary powiązanym z tym artykułem.
.