Test Amesa jest to test biologiczny służący do oceny potencjału mutagennego związków chemicznych. Wykorzystuje bakterie do badania, czy dana substancja chemiczna może powodować mutacje w DNA badanego organizmu. Test został opracowany przez Bruce’a N. Amesa w latach siedemdziesiątych w celu określenia, czy dana substancja chemiczna jest mutagenem.
Cel
Określenie aktywności mutagennej związków chemicznych poprzez obserwację, czy powodują one mutacje w próbce bakterii.
Zasada
- Test Amesa wykorzystuje kilka szczepów bakterii (Salmonella, E.coli), które są nosicielami określonej mutacji.
- Mutacje punktowe są wykonywane w operonie histydyny (Salmonella typhimurium) lub tryptofanu (Escherichia coli), czyniąc bakterie niezdolnymi do wytwarzania odpowiedniego aminokwasu.
- Mutacje te powodują powstanie organizmów his- lub trp-, które nie mogą rosnąć, chyba że dostarczana jest histydyna lub tryptofan.
- Ale hodowla His- Salmonelli jest w podłożu zawierającym pewne substancje chemiczne, powoduje mutację w genie kodującym histydynę, tak że odzyskują one zdolność do syntezy histydyny (His+). Oznacza to, że kiedy dochodzi do zdarzenia mutagennego, substytucje zasad lub przesunięcia ramek w obrębie genu mogą spowodować powrót do prototrofii aminokwasowej. Jest to mutacja odwrotna.
- Te odwrócone bakterie będą wówczas rosły odpowiednio w podłożach ubogich w histydynę lub tryptofan.
Potencjał mutagenny próbki jest oceniany przez wystawienie organizmów wymagających aminokwasów na działanie różnych stężeń substancji chemicznej oraz wybieranie dla zdarzenia odwracającego. Podłoża pozbawione szczególnego aminokwasu są wykorzystywane do tej selekcji, która pozwala tylko tym komórkom, które przeszły rewersję do prototrofii histydyny / tryptofanu na przeżycie i wzrost. Jeżeli próbka badana powoduje tę rewersję, jest ona mutagenem.
Metoda
I ) Wyizolować auksotroficzny szczep Salmonella Typhimurium dla histydyny. (tj. His-ve)
II) Przygotować zawiesinę testową szczepu His-ve Salmonella Typhimurium w zwykłym buforze z badaną substancją chemiczną (np. 2-aminofluorenem). Dodaj również niewielką ilość histydyny.
Uwaga: niewielka ilość histydyny jest wymagana, aby bakterie zaczęły rosnąć. Po wyczerpaniu histydyny tylko bakterie zmutowane w celu uzyskania zdolności do syntezy histydyny tworzą kolonie.
III) Przygotować również zawiesinę kontrolną His-ve Salmonella Typhimurium, ale bez badanych substancji chemicznych.
IV) Inkubować zawiesiny w temperaturze 37°C przez 20 minut
V) Przygotować dwie płytki agarowe i rozprowadzić zawiesinę na płytce agarowej.
VI) Inkubować płytki w temperaturze 37°C przez 48 godzin.
VII) Po 48 godzinach policzyć liczbę kolonii na każdej płytce.
Interpretacja wyników
- Mutagenność substancji chemicznych jest proporcjonalna do liczby zaobserwowanych kolonii.
- Jeżeli na płytce testowej znajduje się duża liczba kolonii w porównaniu z kontrolą, wówczas mówi się, że takie substancje chemiczne są mutagenami.
- Niewielka liczba kolonii może być również widoczna na płytce kontrolnej. Może to być spowodowane spontaniczną mutacją punktową na genie kodującym hisidynę.
Zastosowanie
Choć test Amesa jest wykorzystywany do identyfikacji mutacji powrotnych, które są obecne w szczepach, może on być również wykorzystywany do wykrywania mutagenności próbek środowiskowych, takich jak leki, barwniki, odczynniki, kosmetyki, ścieki, pestycydy i inne substancje, które są łatwo rozpuszczalne w ciekłej zawiesinie.
Merity
- Prosta, szybka i solidna próba bakteryjna.
- Łatwość i niski koszt testu czynią go nieocenionym w badaniach przesiewowych substancji w naszym środowisku pod kątem możliwej rakotwórczości.
- Testmesa może wykrywać odpowiednie mutacje w dużych populacjach bakterii z wysoką czułością.
Ograniczenia
- Niektóre substancje powodujące raka u zwierząt laboratoryjnych (na przykład dioksyny) nie dają pozytywnego wyniku testu Amesa (i odwrotnie)
- Test Amesa składa się ze szczepów Salmonella typhimurium i dlatego nie jest doskonałym modelem dla człowieka.
.