The transwell migration assay jest klasyczną techniką, która pozwala naukowcom na ilościowe określenie ruchu komórek. Migracja odnosi się do zdolności komórek do przemieszczania się indywidualnie lub w skupiskach. Ruch komórek jest możliwy dzięki precyzyjnej restrukturyzacji ich cytoszkieletu, a migracja zwykle występuje w odpowiedzi na bodźce, które działają jak wskazówki.
Dzisiaj omówimy test migracji transwella, który wykorzystuje prostą konfigurację komory do oceny migracji w odpowiedzi na przyciągające wskazówki.
Zaczniemy od przedstawienia kilku informacji na temat komory transwella.
Pierwszą konstrukcję aparatu opracował dr Stephen Boyden w 1961 roku, który używał go do badania migracji leukocytów. Dlatego też metoda ta jest również znana jako test komory Boydena.
W prostej komorze Boydena, zewnętrzna ściana jest ze studzienek, takich jak w płytkach 96-studzienkowych. Wewnątrz każdej studzienki umieszczony jest transwell, który jest cylindryczną wkładką. Wkładka posiada poliwęglanową membranę o określonej wielkości porów. Po umieszczeniu w studzience dzieli ona komorę na dwa przedziały. W górnym przedziale umieszczane są komórki, których zachowania migracyjne mają być badane, a w dolnym zbiorniku umieszczany jest roztwór chemoatraktanta. Z definicji, chemoatraktant jest cząsteczką, która ma zdolność do promowania ruchliwości komórek poprzez „przyciąganie komórek.”
Dzięki tym przyciągającym siłom, komórki w górnym przedziale migrują przez pory do dolnego zbiornika. Jeśli komórki mają właściwości adherentne, jak niektóre komórki czerniaka, po ruchu będą „przyklejać się” do spodniej strony membrany. W tym przypadku, membrana może być utrwalona, zabarwiona, a komórki mogą być policzone pod mikroskopem. Z drugiej strony, komórki nieprzylegające, jak plemniki, będą migrować do dolnego zbiornika. W tym przypadku, komórki w roztworze zbiornika mogą być liczone z pomocą hemocytometru.
Chociaż konfiguracja tego testu jest prosta, jest kilka rzeczy, które należy rozważyć przed eksperymentem. Prześledźmy niektóre z nich.
Począwszy od roztworu do posiewu, należy upewnić się, że gęstość jest optymalna do obserwacji migracji komórek. Zbyt mała liczba komórek może spowodować niewykrywalną migrację, a większa gęstość spowoduje przeludnienie membrany, utrudniając wyliczenie migracji. Drugą kwestią jest wielkość porów wkładki. Powinien on być starannie dobrany w zależności od typu komórek. Jeśli wielkość porów jest zbyt mała, komórki nie będą w stanie przez nie przejść.
Alternatywnie, jeśli wielkość porów jest zbyt duża, komórki będą po prostu przez nie wpadać, co nie jest migracją. Wreszcie, należy pamiętać o stężeniu chemoatraktantu i czasie inkubacji, który ma być dozwolony dla migracji, ponieważ są one wzajemnie zależne. Optymalne stężenie z odpowiednim czasem inkubacji, podczas którego utrzymywany jest gradient stężeń pomiędzy kompartmentami, indukuje migrację komórek w wyniku chemoatrakcji. I odwrotnie, przedłużonym inkubacjom może towarzyszyć wyrównywanie chemoatraktantów w całej komorze prowadzące do utraty gradientu chemicznego, co może zagmatwać analizę uzyskanych wyników.
Mając te rozważania na uwadze, omówmy protokół stosowany do pomiaru migracji komórek adherentnych.
Komórki, które mają być badane są przygotowywane w medium wolnym od proteaz, ponieważ proteazy mogą denaturować ważne receptory błonowe i ostatecznie wpływać na migrację. Po przygotowaniu komórek, zawiesina powinna być rozcieńczona do optymalnej gęstości wysiewu. W celu przygotowania komory, płytki transwersalne umieszcza się w dołkach na płytce wielokomorowej. Zawiesina komórek powinna być pipetowana do komory transwell bez dotykania membrany lub wprowadzania pęcherzyków powietrza.
Roztwór chemoatraktantu jest pipetowany do dolnego zbiornika, upewniając się, że roztwór dotyka membrany wkładki. Czas inkubacji dla migracji będzie zależał od względów eksperymentalnych. Po inkubacji, membrany są utrwalane przez zanurzenie wkładki w 70% etanolu. Po wysuszeniu wkładki dodaje się roztwór do barwienia komórek.
Następnie komórki inkubuje się przez około 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji, wkładki są przemywane za pomocą buforu do przemywania. Wreszcie, membrana może być wycięta i umieszczona na szkiełku mikroskopowym. Komórki na spodniej stronie membrany reprezentują liczbę komórek, które migrowały w obecności i nieobecności chemoatraktantów.
Ponieważ, teraz już czujesz protokół, spójrzmy krótko na to, jak naukowcy używają tej metody w swoich badaniach.
Jednym z najczęstszych zastosowań tego testu jest ocena właściwości chemoatrakcyjnych nieznanych związków. W tym przypadku naukowcy byli zainteresowani zbadaniem toru pływania plemników żaby w obecności alluryny, która jest substancją wydzielaną przez jaja płazów. W tym celu najpierw pipetą nanieśli aktywne żabie plemniki na górną część wkładek transwaginalnych. Na dno dodali allurynę. Po umożliwieniu komórkom migracji liczyli pod mikroskopem plemniki w roztworze zbiornikowym. Używając tej techniki, byli w stanie wygenerować krzywą stężenie-odpowiedź przedstawiającą wpływ stężenia alluryny na migrację plemników.
Gdy komórka jest atakowana przez patogeny, wysyła chemoatraktanty, aby zwerbować komórki odpornościowe, które migrują, przyczepiają się, a następnie rozwiązują infekcję. Aby sprawdzić to zjawisko, naukowcy hodowali komórki nabłonkowe na spodniej stronie wkładek. Następnie zainfekowali te komórki różnymi szczepami bakterii. Na koniec do górnej komory wprowadzili komórki odpornościowe. Wiadomo, że zainfekowane komórki wytwarzają kilka chemoatraktantów, które indukują migrację komórek odpornościowych. Wyniki tego eksperymentu wykazały różne stopnie migracji neutrofili w odpowiedzi na różne rodzaje infekcji bakteryjnej.
Na koniec, inwazja komórek nowotworowych i przerzuty przez macierz zewnątrzkomórkową zawsze intrygowały biologów komórkowych. Tutaj naukowcy chcieli ustalić, w jaki sposób specyficzne chemoatraktanty mogą przyczynić się do takiej migracji przez macierz 3D. Zmodyfikowali genetycznie dwie oddzielne pule komórek: jedną wyrażającą białko zielonej fluorescencji, a drugą czerwonej fluorescencji. Następnie pipetowali macierz zewnątrzkomórkową do górnej części dołków transwaginalnych.
Po zestaleniu, odwrócili dołek transwaginalny i posiali dwie pule komórek na spodnią stronę membrany. Następnie wymienili wkładkę na płytkę wielokomorową i wprowadzili pipetą roztwór chemoatraktanta do górnej komory. To spowodowało, że komórki znajdujące się na dole poruszały się w górę i przez matrycę 3D. Z pomocą obrazowania konfokalnego, badacze odtworzyli migrację komórek w 3D i rozróżnili wzorce migracji dwóch grup komórek.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat testu migracji transwella. Rozumiejąc składniki i protokół tej metody, wiesz teraz, dlaczego jest ona tak szeroko stosowana przez biologów komórkowych. Pomimo prostoty tego zestawu, zakres konfiguracji, które ta metoda może zaadaptować, czyni ją niezastąpioną w badaniach ruchliwości komórek. Jak zawsze, dzięki za oglądanie!