Wrażliwość przeciwbakteryjna in vitro Aerococcus urinae na 14 antybiotyków, oraz krzywe time-kill dla penicyliny, gentamycyny i wankomycyny

Abstract

Aerococcus urinae jest nowym patogenem w praktyce klinicznej i mikrobiologicznej, powodującym zakażenia dróg moczowych, bakteriemię/wrzodozę i/lub zapalenie wsierdzia. W niniejszej pracy po raz pierwszy przedstawiono ocenę aktywności reprezentatywnego panelu antybiotyków wobec dużej liczby izolatów A. urinae. Metodą rozcieńczeń agarowych określono wrażliwość in vitro (MIC) 56 izolatów A. urinae na 14 antybiotyków. Ogólnie, izolaty A. urinae wykazywały małą zmienność międzyizolacyjną i miały niskie MIC na penicylinę, amoksycylinę, piperacylinę, cefepim, wankomycynę i rifampicynę. U żadnego z izolatów nie stwierdzono wysokiego poziomu oporności na aminoglikozydy. Umiarkowaną lub dobrą aktywność obserwowano w przypadku chinolonów, erytromycyny i tetracykliny. Izolaty pochodzące od dwóch pacjentów z zapaleniem wsierdzia badano za pomocą krzywych time-kill dla penicyliny, gentamycyny i wankomycyny. Penicylina i wankomycyna same w sobie wykazywały powolną aktywność bakteriobójczą lub nie wykazywały jej wcale w stosunku do tych dwóch szczepów. W przypadku połączenia penicyliny lub wankomycyny z gentamycyną, uzyskano szybką aktywność bakteriobójczą dla obu szczepów w obu kombinacjach. Opcje leczenia A. urinae wydają się obejmować penicyliny w mniej ciężkich przypadkach. W ciężkich przypadkach, tj. zapalenie wsierdzia, badania time-kill wskazują na korzystny efekt połączenia z gentamycyną. U pacjentów uczulonych na penicylinę wankomycyna w połączeniu z gentamycyną stanowi najbardziej oczywistą alternatywę.

Wprowadzenie

W ciągu ostatniej dekady wiele uwagi poświęcono znaczeniu klinicznemu różnych katalazoujemnych, Gram-dodatnich kokcytów.1 Wśród nich Aerococcus urinae jest nowicjuszem w praktyce klinicznej i mikrobiologicznej, zgłoszonym po raz pierwszy w 1989 r.2 i oznaczonym w 1992 r.3A. Pierwotnie izolaty Aerococcus urinae rozpoznawano na podstawie morfologii komórek (Staphylococcus-like w barwieniu metodą Grama) i cech wzrostu (przypominających paciorkowce α-hemolizujące na agarze z krwią), ujemnej reakcji katalazy oraz bardzo stałego antybiogramu wykazującego wrażliwość na penicylinę i oporność na sulfonamidy i aminoglikozydy.2-4 W dwóch doniesieniach szczepy A. urinae zostały wyizolowane z 0,4-0,8% badanych próbek moczu.2,5 Większość pacjentów, od których izolowano A. urinae, była w podeszłym wieku, ze schorzeniami predysponującymi i objawami zakażenia dróg moczowych.2,4,5 Szczepy wywołujące zakażenia dróg moczowych zostały rozpoznane w Danii, Szwecji, Holandii, Francji, USA, Kanadzie i krajach Ameryki Południowej.6A. urinae został również wyizolowany z krwi pacjentów cierpiących na bakteriemię/wrzodozę urologiczną z lub bez zapalenia wsierdzia.7-11 W ogólnokrajowym badaniu przeprowadzonym w Danii w latach 1987-1995 zidentyfikowano 26 pacjentów z A. urinae wyizolowanym z krwi,6 co odpowiada 0,5 pacjenta/rok/1 mln mieszkańców i 0,8% epizodów infekcyjnego zapalenia wsierdzia.8 Epizody bakteriemii/wrzodu dobrze reagowały na leczenie samymi β-laktamami lub w połączeniu z aminoglikoidem, chyba że bakteriemia była powikłana zapaleniem wsierdzia, w którym to przypadku pięciu z sześciu pacjentów zmarło. U jednego pacjenta A. urinae mógł być wyhodowany podczas autopsji z zastawek, pomimo pozornie odpowiedniego leczenia antybiotykami. Dlatego też należy określić optymalny sposób leczenia zapalenia wsierdzia wywołanego przez A. urinae.

Badanie izolatów A. urinae metodą dyfuzyjno-tarczową wykazało wrażliwość na szeroki zakres środków przeciwdrobnoustrojowych, w tym zarówno antybiotyki β-laktamowe, jak i nie-β-laktamowe.5,6,12 Ponieważ izolaty A. urinae były głównie związane z zakażeniami dróg moczowych, warto zauważyć, że szczepy te okazały się oporne na sulfonamidy i inne środki przeciwdrobnoustrojowe stosowane w leczeniu zakażeń dróg moczowych, w tym kotrimoksazol, trimetoprim, kwas nalidyksowy i polimyksyny.2,5,6,12 Ostatnio zbadano wrażliwość dwóch izolatów A. urinae pochodzących od pacjentów z zapaleniem wsierdzia na MIC siedmiu antybiotyków oraz wykonano krzywe czasowe dla penicyliny w połączeniu z gentamycyną lub netilmycyną.11 W obecnym badaniu scharakteryzowano wzór wrażliwości 56 izolatów A. urinae o różnym pochodzeniu geograficznym. Oznaczono MIC 14 antybiotyków, a dla dwóch izolatów przeprowadzono eksperymenty na krzywej czasowej z penicyliną, gentamycyną i wankomycyną, pojedynczo lub w kombinacji, w celu uzyskania większej ilości informacji na temat optymalnych schematów leczenia poważnych infekcji wywołanych przez A. urinae.

Materiały i metody

Strains

Przebadano 56 klinicznych izolatów A. urinae, obejmujących 42 duńskie izolaty (17 izolatów krwi i 25 izolatów moczu) oraz 14 nie-duńskich izolatów moczu: jeden z Holandii (uprzejmie udostępniony przez P. J. G. M. Rietra), cztery ze Szwecji (uprzejmie udostępniony przez E. Falsen, Culture Collection, University of Göteborg) oraz siedem izolatów z Ameryki Północnej (uprzejmie udostępniony przez R. R. Facklam, The Streptococcus Laboratory, CDC, Atlanta, GA, USA). Użyto następujących szczepów referencyjnych: Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATTC 25922 i Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Środki przeciwdrobnoustrojowe

Stosowano następujące środki przeciwdrobnoustrojowe: benzylopenicylina (Leo, Ballerup, Dania); cefepim (Bristol-Myers Squibb, Wallingford, CT, USA); amoksycylina, ceftriakson, erytromycyna, amikacyna, gentamycyna, netilmicyna, rifampicyna, wankomycyna (Sigma, St Louis, MO, USA); oksytetracyklina (Rosco, Taastrup, Dania), piperacylina (Lederle, Pearl River, NY, USA), ciprofloksacyna (Bayer, Leverkusen, Niemcy); i sparfloksacyna (Rhône Poulenc Rorer, Vitry, Francja).

Określanie MIC

W związku z szybkim wzrostem A. urinae konieczne było zmodyfikowanie warunków badania w stosunku do standardowych zaleceń w celu wykonania oznaczeń MIC (tj. 5% dodatek krwi do agaru i inkubacja w 5% atmosferze CO2 przez 48 h).13-15 MIC oznaczano metodą rozcieńczeń agarowych. Dwukrotnie seryjne rozcieńczenia środków przeciwbakteryjnych przygotowywano w agarze Mueller-Hinton (Difco Laboratories GmbH, Augsburg, Niemcy) uzupełnionym 5% zlizowaną krwią końską. Antybiotyki badano w stężeniach od 0,008 do 512 mg/L, z wyjątkiem amoksycyliny (0,032-256 mg/L), rifampicyny (0,008-32 mg/L) i oksytetracykliny (0,008-2 mg/L). Inokulacje 107 cfu/mL (104 cfu/spot) przygotowano z całonocnych hodowli agarowych i zawieszono w 0,9% NaCl, a następnie zastosowano 21-punktowy inokulator wielokrotny (Denley Instruments Ltd, Billinghurst, UK). Wyniki odczytywano po inkubacji przez 2 dni w temperaturze 37°C w 5% CO2. MIC odczytywano jako najniższe stężenie wykazujące wzrost maksymalnie trzech kolonii.

Badania krzywej czasowej

Badano dwa z badanych izolatów krwi (B1 i B8), oba pochodzące od pacjentów z zapaleniem wsierdzia. Szczepy były badane przeciwko penicylinie (MIC odpowiednio 0,125 i 0,6 mg/L), gentamycynie (MIC odpowiednio 256 i 64 mg/L) i wankomycynie (MIC odpowiednio 0.5 i 1 mg/L, odpowiednio) w następujących klinicznie osiągalnych stężeniach: penicylina 2 × i 10 × MIC (odpowiednio P2 i P10); wankomycyna 4 × i 10 × MIC (odpowiednio V4 i V10); gentamycyna 10 mg/L (G10); oraz kombinacje penicylina + gentamycyna i wankomycyna + gentamycyna w następujących stężeniach: P2G10, P10G10, V4G10 i V10G10, odpowiednio. W t = -1 h świeże, wyhodowane przez noc kolonie zawieszano do około 105 jtk/mL w probówkach z ogrzanym wcześniej bulionem Todda-Hewitta. Probówki umieszczano w łaźni wodnej w temp. 37°C. W t = 0 h antybiotyki, przygotowane bezpośrednio przed badaniem, dodawano do probówek w dwóch egzemplarzach. Trzy probówki bez antybiotyków zostały użyte jako kontrola wzrostu. Próbki z każdej probówki pobierano w dwóch egzemplarzach po 0, 3, 6 i 24 godzinach. Próbki były seryjnie rozcieńczane i posiewane na płytki. Liczbę przeżywających kolonii liczono po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C w powietrzu atmosferycznym w plastikowych torebkach wraz z wilgotną bibułą. Przy użyciu próbek o objętości 20 μL minimalna możliwa do policzenia liczba bakterii wynosiła 50 cfu/mL. Efekt przenoszenia został wyeliminowany dla eksperymentów penicylina-gentamycyna przez dodanie 100 μL 100 000 U/mL penicylinazy do każdej płytki. W przypadku doświadczeń z wankomycyną-gentamycyną efekt przeniesienia został wyeliminowany przez rozcieńczenie. Badanie pilotażowe wykazało efekt przeniesienia w próbce 100, ale nie w próbce 10-1, w związku z czym cfu zostały policzone przy użyciu 200 μL próbki 10-1, co nadal daje granicę wykrywalności 50 cfu/mL. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono co najmniej dwukrotnie w oddzielnych dniach. Aktywność bakteriobójczą zdefiniowano jako redukcję inokulum o co najmniej 99,9% w ciągu 24 h. Synergię (S), efekt addytywny (A) i antagonizm zdefiniowano jako: >2 log więcej zabijania (S), >1 i <2 log więcej zabijania (A) i >2 log zmniejszone zabijanie, odpowiednio, dla kombinacji w porównaniu z najlepszym z pojedynczych antybiotyków.

Wyniki

Wyznaczanie MIC

MIK uzyskane dla 56 izolatów przedstawiono w Tabeli. Przy zastosowaniu punktów krytycznych dla paciorkowców zalecanych przez NCCLS14,15 lub przez Swedish Reference Group of Antibiotics (SRGA),16,17 izolaty były wrażliwe na penicyliny, natomiast obniżoną wrażliwość stwierdzono dla badanych cefalosporyn. Wartości MIC dla aminoglikozydów wskazywały na zmniejszoną wrażliwość prawie wszystkich izolatów. Jednak u żadnego z izolatów nie stwierdzono oporności na aminoglikozydy wysokiego stopnia (tj. gentamycyna > 1000 mg/L). Wszystkie izolaty były wrażliwe na wankomycynę. Rifampicyna była najbardziej aktywnym badanym lekiem z MIC50 wynoszącym 0,031 mg/L (zakres <0,004-0,064 mg/L), z wyjątkiem jednego izolatu, u którego MIC > 32 mg/L (badanie powtórzone). Aktywność chinolonów ciprofloksacyny i sparfloksacyny okazała się równie dobra.

Badania krzywej zabijania

Średnie krzywe zabijania w czasie dla każdego eksperymentu przedstawiono na rycinie. Sama wankomycyna (zarówno 4 × jak i 10 × MIC) wykazywała aktywność bakteriobójczą wobec szczepu B1. Dla penicyliny aktywność bakteriobójczą stwierdzono tylko dla 10 × MIC wobec B8. Dla obu antybiotyków efekt bakteriobójczy był powolny, tzn. po raz pierwszy pojawił się po 24 h. Gentamycyna nie była bakteriobójcza – w większości eksperymentów obserwowano wzrost. Penicylina w połączeniu z gentamycyną działała synergistycznie i była szybko bakteriobójcza dla szczepu B8 zarówno w P2G10 jak i P10G10. Natomiast dla szczepu B1 stwierdzono jedynie addytywny i powolny efekt bakteriobójczy. W przypadku połączenia wankomycyny z gentamycyną stwierdzono szybki efekt bakteriobójczy dla obu szczepów. Efekt synergistyczny był wykrywalny po 3 h i 6 h dla szczepu B8. W ciągu 24 h zabójcza aktywność wankomycyny była jednak tak wyraźna, że nie można było wykryć efektu synergicznego. Dla B1 stwierdzono jedynie efekt addytywny. W żadnym z eksperymentów nie odnotowano efektów antagonistycznych.

Dyskusja

W niniejszym opracowaniu po raz pierwszy przedstawiono ocenę MIC reprezentatywnego panelu antybiotyków wobec dużej liczby izolatów A. urinae uzyskanych od pacjentów z zakażeniem dróg moczowych, bakteriemią/wrzodowiskiem i/lub zapaleniem wsierdzia. W celu oceny wykorzystania antybiogramów do celów taksonomicznych, MIC 15 antybiotyków dla 10 szczepów A. urinae zostały zbadane wcześniej,12 ale szczegółowe dane nie zostały przedstawione.

A. urinae są organizmami szybko rosnącymi, wymagającymi uzupełnienia krwi w podłożach, a czasami inkubacji w atmosferze wzbogaconej w CO2 i/lub przedłużonego okresu inkubacji w celu uzyskania wystarczającego wzrostu do badania wrażliwości na antybiotyki. Z tego powodu szczepy nie mogły być badane w standardowych warunkach opisanych przez BSAC lub NCCLS.13-15 Konieczność modyfikacji warunków hodowli jest jednak częstym problemem w przypadku szybko rosnących bakterii Gram-dodatnich.18,19 Izolaty A. urinae wykazywały wzór wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe podobny do wzoru wrażliwości paciorkowców α-hemolizujących z jedynie niewielkimi różnicami wrażliwości między izolatami. Wartości MIC β-laktamów dla izolatów mieściły się zazwyczaj w czterech dwukrotnych stopniach rozcieńczenia, z wyjątkiem cefalosporyn ceftriaksonu i cefepimu, które wykazywały większą zmienność MIC (tabela). Ze względu na możliwy wpływ inkubacji w CO2 (obniżenie pH), należy zachować ostrożność przy ocenie wrażliwości na tetracyklinę (wrażliwość przeszacowana) i erytromycynę (wrażliwość niedoszacowana). Wśród badanych izolatów A. urinae nie zidentyfikowano wysokiego poziomu oporności na badane aminoglikozydy, co pozostawia otwartą możliwość efektu synergicznego w połączeniu z β-laktamem lub wankomycyną (vide infra). Zgodnie z oceną MIC istnieje kilka alternatywnych metod leczenia poważnych zakażeń, ponieważ izolaty były wrażliwe na penicyliny, wankomycynę i rifampicynę (z wyjątkiem jednego izolatu). Wybrane chinolony, ciprofloksacyna i sparfloksacyna, również wykazywały dobrą aktywność. Mimo że jest to drobnoustrój wymagający, wyniki uzyskane metodą dyfuzyjno-krążkową2,5,20 były zgodne z MIC przedstawionymi w tym badaniu, co sugeruje, że można uzyskać wiarygodne wyniki przy użyciu tych rutynowych metod oznaczania wrażliwości.

Wytyczne dotyczące leczenia poważnych zakażeń, takich jak posocznica z zapaleniem wsierdzia lub bez niego, powinny być optymalnie oparte na doświadczeniu klinicznym w starannie zaprojektowanych badaniach, ale jest to trudne, gdy mamy do czynienia z rzadkimi bakteriami. Dlatego badania in vitro, w tym techniki krzywej zabijania, mogą w tych przypadkach dostarczyć klinicyście ważnych informacji.

Do doświadczeń wybrano stężenia antybiotyków osiągalne in vivo. W przypadku gentamycyny wybrano dawkę 10 mg/l, co odpowiada stężeniu uzyskiwanemu przy podawaniu raz dziennie 240 mg (co odpowiada 3-4 mg/kg).21 Ponadto, chociaż w kilku pracach zaleca się podawanie gentamycyny dwa razy dziennie w przypadku zapalenia wsierdzia, w Danii powszechnie stosuje się gentamycynę raz dziennie, ze względu na zmniejszenie nefrotoksyczności oraz fakt, że efekt synergistyczny z antybiotykami β-laktamowymi zwiększa się wraz ze wzrostem stężenia aminoglikozydów.22 Dane uzyskane w naszym badaniu in vitro krzywych zabijania dla penicyliny i wankomycyny wykazały, że ani penicylina, ani wankomycyna nie były bakteriobójcze wobec żadnego z dwóch izolatów badanych od pacjentów z infekcyjnym zapaleniem wsierdzia. W połączeniu z gentamycyną uzyskano efekt bakteriobójczy wobec obu izolatów zarówno w przypadku penicyliny, jak i wankomycyny. Na szczęście te schematy są zalecane w leczeniu infekcyjnego zapalenia wsierdzia o nieznanej etiologii na całym świecie.23 Szybkość zabijania dwóch szczepów była różna, co wskazuje na możliwość istnienia różnic między szczepami. Pomimo wrażliwości in vitro na podane antybiotyki, stwierdziliśmy, że rokowanie było złe dla pacjentów w podeszłym wieku cierpiących na infekcyjne zapalenie wsierdzia wywołane przez A. urinae.8 Obecne wyniki dla penicyliny, gentamycyny i netilmycyny (MIC) są zgodne z wynikami w niedawnym szwajcarskim raporcie Zbindena i wsp.11 dla dwóch izolatów A. urinae pochodzących od pacjentów z zapaleniem wsierdzia.

Możliwości leczenia A. urinae wydają się obejmować penicyliny w mniej ciężkich przypadkach. W ciężkich przypadkach, tj. w zapaleniu wsierdzia, badania time-kill sugerują korzyści z połączenia penicyliny lub wankomycyny z gentamycyną. U pacjentów uczulonych na penicylinę wankomycyna stanowi najbardziej oczywistą alternatywę.

Tabela.

MIC 14 środków przeciwbakteryjnych A. urinae (n = 56)

Górna granica wrażliwości dla paciorkowców wg NCCLS15 lub wg SRGA16,17 zaznaczona szarym cieniowaniem.

aLiczba szczepów.

bMIC *< 0,032 mg/L.

cMIC > 32 mg/L.

dMIC > 2 mg/L

Tabela.

MIC 14 środków przeciwbakteryjnych A. urinae (n = 56)

Górna granica wrażliwości dla paciorkowców wg NCCLS15 lub wg SRGA16,17 zaznaczona szarym cieniowaniem.

aLiczba szczepów.

bMIC *< 0,032 mg/L.

cMIC > 32 mg/L.

dMIC > 2 mg/L

.