Exprimarea și purificarea GyrB și GyrA
Secvența care codifică GyrA de lungime completă din E. coli (2-875) a fost inserată într-un pET28b modificat care conține o etichetă N-terminală 10-His și o etichetă C-terminală Twin-strep. Supraexprimarea a fost realizată în E. coli BL21 (DE3) pRARE2 în mediu LB care conține 50 µg/mL de kanamicină și 35 µg/mL de cloramfenicol. Celulele au fost induse cu 0,35 mM IPTG după ce au atins o DO600 0,85, iar proteina a fost exprimată la 37 °C timp de 4 h. Celulele au fost recoltate și resuspendate în tampon de liză (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, 10% v/v glicerol, pH 8,0) și lizate cu trei cicluri de întrerupere la presiune înaltă folosind EmulsiFlex-C3 la 1500 bari. Proteina GyrA a fost purificată prin cromatografie de afinitate cu nichel pe o coloană XK 26/20 (Pharmacia) împachetată manual cu rășină Chelating Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) legată de ioni Ni2+. Eluția a fost efectuată cu tamponul de liză care conține 250 mM imidazol pH 8,0, iar proteinele eluate au fost atașate direct pe o Sefaroză Streptavidin de 10 ml (GE Healthcare). Proteinele au fost spălate intensiv cu tampon Strep (20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glicerol, pH 8,0) și eluate cu tampon Strep care conține 3 mM Desthiobiotin (Sigma-Aldrich). Atât marcajul 10-His, cât și marcajul Twin-strep au fost ulterior scindate de protează PreScission (P3C) și de scindarea Tobacco Etch Virus (TEV) (raport de masă 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) peste noapte la 4 °C. GyrA a fost apoi purificat în continuare printr-o etapă de cromatografie cu schimb de anioni utilizând o coloană HiTrap Q HP (GE Healthcare). Proteina a fost eluată cu un gradient liniar de 20 de volume de coloană cu tampon B (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glicerol, pH 8,0). Fracțiunile care conțin GyrA au fost grupate și încărcate pe o coloană de cromatografie de excludere a dimensiunilor Superdex S200 16/60 (GE Healthcare) folosind 20 mM Hepes, 50 mM NaGlu, 50 mM KAc, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10% v/v glicerol, pH 8,0. S-au obținut 37 mg de GyrA din 3 L de culturi. Secvența codificatoare GyrB (2-804) a fost inserată în același pET28b modificat. Supraexprimarea a fost realizată în E. coli BL21 (DE3) pRARE2 în mediu LB care conține 50 µg/mL de kanamicină și 35 µg/mL de cloramfenicol. Celulele au fost induse cu 0,35 mM IPTG după ce au atins o DO600 0,85, iar proteina a fost exprimată la 18 °C timp de 18 ore. S-au obținut 10 mg de GyrB din 3 L de culturi.
Reconstituirea completă a ADN-girasei
E. coli GyrA și GyrB au fost amestecate în raport echimolar pentru a permite reconstituirea completă a ADN-girasei. Complexul a fost purificat în continuare pe o coloană de cromatografie de excludere a dimensiunilor Superdex S200 16/60 (GE Healthcare) folosind tamponul crio-EM (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0,5 mM TCEP, pH 8,0) (Fig. 1 și Fig. suplimentară. 1).
Prepararea acidului nucleic
Un duplex de ADN de 180 pb cu dublă ramificare a fost reconstituit folosind 2 oligonucleotide sintetice asimetrice fosforilate12 obținute de la Sigma-Aldrich (tabelul suplimentar 1). Pe scurt, acizii nucleici au fost dizolvați în apă fără ADNse la o concentrație de 1 mM. Pentru a asambla ADN bicatenar, fiecare oligo a fost amestecat în raport molar de 1:1, a fost recorectat prin incubare la 95 °C timp de 2 min și apoi prin scăderea temperaturii cu 1 °C la fiecare 1 min până când s-a ajuns la 20 °C. Duplexul de ADN îndoit recorectat a fost apoi schimbat în tampon în Hepes 20 mM pH 8,0 cu o coloană BioSpin 6 (BioRad).
Formarea complexului pentru crio-EM
ADN-girasa purificată a fost amestecată cu ADN ds de 180 bp în raport molar 1:1 cu o concentrație finală de proteină și ADN de 32 µM. Amestecul a fost incubat timp de 10 min la 37 °C. S-a adăugat gepotidacina (GSK2140944, achiziționată de la MedChemExpress) resuspendată la 10 mM în DMSO 100% pentru a se ajunge la o concentrație finală de 170 µM (1,7% DMSO). Amestecul a fost incubat timp de 10 minute la 37 °C. AMP-PNP (Sigma) a fost adăugat la complex la o concentrație finală de 340 µM. Complexul complet reconstituit a fost incubat în continuare 30 min la 30 °C. În cele din urmă, la complex s-a adăugat 8 mM CHAPSO (Sigma-Aldrich). Proba a fost centrifugată 2 h la 16.000 × g pentru a elimina potențialele agregate.
Prepararea grilei crio-EM
Grilele de cupru Quantifoil R-1.2/1.3 cu ochiuri de 300 mesh au fost încărcate cu incandescență timp de 20 s înainte de aplicarea a 4 µl de complex. După 30 s de incubare, grilele au fost congelate prin imersie în etan lichid folosind un Vitrobot mark IV (FEI) cu o umiditate a camerei de 95% la 10 °C.
Microscopie electronică
Imaginile crio-EM au fost realizate pe un microscop Titan Krios operat la 300 kV (FEI) echipat cu o cameră de electroni direcți K2 Summit (Gatan), un filtru de energie GIF Quantum (Gatan) operat în modul de pierdere de energie zero cu o lățime a fantei de 20 e-V, o placă de fază Volta (FEI) și un corector CS (FEI). Imaginile au fost înregistrate în modul nano sondă EFTEM cu Serial EM53 în modul de numărare cu super-rezoluție la o mărire nominală de 130 000x cu o dimensiune a pixelului de super-rezoluție de 0,44 Å și o țintă de defocalizare constantă de -500 nm (Fig. suplimentară 2c). VPP a fost avansat la o nouă poziție la fiecare 100 min (Fig. suplimentară 2b). Au fost colectate patru seturi de date cu o rată de dozare de 6-8 e-/pixel/s (dimensiunea pixelului de 0,88 Å la specimen) pe detector. Imaginile au fost înregistrate cu o doză totală de 50 e-/Å2, timp de expunere între 7 și 10 s și subcadre de 0,2 până la 0,25 s (35 până la 50 de cadre în total). Un total de 11.833 de filme au fost înregistrate după colectarea datelor din cele 4 seturi de date.
Procesarea datelor
Procesarea datelor din fiecare set de date a fost făcută separat, urmând aceeași procedură până la rafinamentele 3D, când particulele au fost unite. Subframele de super-rezoluție fracționate în funcție de doză au fost corectate în funcție de câștig cu IMOD54 și clasificate de două ori prin decupare Fourier, corectate în funcție de derivă și ponderate în funcție de doză folosind MotionCor255, obținându-se imagini însumate cu o dimensiune a pixelilor de 0,88 Å. Funcția de transfer de contrast a micrografiilor corectate a fost estimată cu ajutorul GCTF v1.0656. Inelele Thon au fost inspectate manual pentru astigmatism, iar micrografiile cu rezoluții măsurate mai mici de 4 Å au fost eliminate, rezultând 8.701 micrografiile rămase. Particulele au fost selectate automat cu ajutorul protocolului Gaussian blob picking fără referință în RELION229,30. Luând împreună cele 4 seturi de date, au fost selectate în total 1.572.962 de particule. Particulele clasificate de patru ori din fiecare set de date au fost supuse separat la două runde de clasificare 2D în RELION2 pentru a elimina particulele nedorite și contaminările, rezultând un total de 479.667 de particule pentru procesarea ulterioară. Particulele din cele patru seturi de date au fost fuzionate într-un singur set de date, urmat de o reextracție cu centrare în format 3 × 3 binned. Apoi a fost efectuată o ultimă rundă de clasificare 2D, rezultând o stivă finală de particule de 338 616 particule. Stiva de particule ulterioară a fost supusă unei runde de clasificare ab-initio 3D în cryoSPARC31. După ce au fost eliminate modelele de calitate slabă, modelul ab-initio rămas a dus la un set de date final de 191 456 de particule, cu un prag de probabilitate de clasă de 0,9 (Fig. suplimentară 2a). Modelul ab-initio a fost filtrat prin metoda low-pass la 30 Å și a fost utilizat ca referință pentru rafinarea omogenă în cryoSPARC, rezultând o hartă de 5,4 Å. Coordonatele particulelor rafinate au fost apoi utilizate pentru estimarea locală a CTF cu ajutorul GCTF v1.06, urmată de re-extragerea particulelor 2 × 2 binned cu centrare. Această nouă stivă de particule a fost supusă unei auto-refinări 3D în RELION2 utilizând modelul ab-initio filtrat low-pass la 30 Å, rezultând o hartă cu o rezoluție globală de 5,0 Å (Fig. Suplimentară 3). Rezoluția locală a arătat o gamă de rezoluții de la 4,0 Å în nucleul de legare/coagulare a ADN-ului până la 9,0 Å în domeniul ATPază și în roata β GyrA care înfășoară ADN-ul, ceea ce indică o flexibilitate ridicată a acestor două module. Pentru a obține o reconstrucție finală a complexului complet cu densități bine definite pentru fiecare domeniu, am efectuat o clasificare 3D fără aliniere, obținând mai multe clase diferite. Particulele din trei clase au fost fuzionate (94.633 de particule). Stiva ulterioară de particule 1 × 1-binned a fost rafinată în RELION2 fără mască până la iterațiile de rafinare târzii, unde a fost aplicată o mască soft pentru a îmbunătăți rezoluția. Prelucrarea ulterioară a hărții a produs o reconstrucție a complexului global la o rezoluție de 6,6 Å (Fig. Suplimentară 3).
A fost utilizată o combinație de diferite abordări locale pentru a identifica diferite conformații și pentru a îmbunătăți rezoluția locală a fiecărui domeniu. Deoarece domeniul ATPază a fost prea mic pentru o rafinare focalizată 3D, am efectuat mai întâi o clasificare 3D focalizată a domeniului ATPază cu o mască moale și fără aliniere în RELION2. A fost selectată o clasă de 58.329 de particule cu o densitate bine definită a domeniului ATPazei, urmată de re-extragerea particulelor 1 × 1-binned, obținându-se particule cu o dimensiune a pixelului de 0,88 Å/pixel. Pentru a facilita o aliniere precisă a particulelor, această clasă a fost rafinată în continuare în RELION2 folosind o mască moale în jurul domeniului ATPază și al domeniului de legare/lichidare a ADN-ului, obținând o hartă cu o rezoluție globală de 5,9 Å (ATPase-Core) (Fig. suplimentară 3).
În al doilea rând, am efectuat o clasificare 3D focalizată a roții GyrA β-pinwheel cu o mască moale și fără aliniere în RELION2. A fost selectată o clasă de 45.040 de particule cu o densitate bine definită a roții GyrA β-pinwheel, urmată de re-extragerea particulelor 1 × 1-binned, obținând particule cu o dimensiune a pixelului de 0,88 Å/pixel. Această clasă a fost rafinată în continuare în RELION2 utilizând o mască moale în jurul roții β-pinwheel și a domeniului de legare/cleavage a ADN-ului, obținându-se o hartă cu o rezoluție de 6,3 Å (CTD-Core) (Fig. suplimentară 3).
În cele din urmă, în RELION2 s-a efectuat o auto-rafinare 3D focalizată, utilizând o mască moale în jurul domeniului de legare/cleavage a ADN-ului. Post-procesarea hărții a produs o reconstrucție la o rezoluție de 4,3 Å a domeniului de legare/cleavage a ADN-ului. Apoi, a fost realizată o clasificare 3D focalizată a domeniului de legare/cleavage a ADN-ului. Două dintre clase au arătat precizii unghiulare mai bune și conformații distincte închise (60.548 de particule) și de predeschidere (53.655 de particule) ale domeniului de legare/cleavare a ADN-ului. Aceste două clase au fost rafinate în continuare în RELION2 prin rafinare 3D focalizată cu o simetrie C2 utilizând particule 1 × 1 binned și au dat reconstrucții cu o rezoluție globală de 4,0 și, respectiv, 4,6 Å după postprocesare (Fig. Suplimentară 3). Domeniul închis de legare/lichidare a ADN-ului a fost rafinat în continuare prin rafinare 3D focalizată utilizând o mască moale, care exclude inserția TOPRIM dezordonată, ceea ce a dat o hartă de 4,0 Å de înaltă calitate (Fig. Suplimentară 3).
Toate rezoluțiile raportate se bazează pe criteriul standard de aur FSC-0,14357 , iar curbele FSC au fost corectate pentru efectele de convoluție ale unei măști moi utilizând înlocuirea zgomotului de înaltă rezoluție58 în RELION2, precum și în crioSPARC (Fig. suplimentară 4a). Toate reconstrucțiile au fost ascuțite prin aplicarea unui factor B negativ care a fost estimat cu ajutorul unor proceduri automate59. Rezoluția locală a hărților a fost calculată cu ajutorul Blocres60 (Fig. suplimentară 4c). Hărțile crio-EM ale complexului global, ale miezului ATPazei, ale miezului CTD și ale domeniului de legare a ADN-ului/cleavage în stare închisă (cu și fără inserția TOPRIM) și în stare de predeschidere au fost depuse în EM Data Bank sub numerele de acces EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909, EMD-4912, respectiv EMD-4912.
Constituirea și rafinarea modelului
Reconstrucția EM a domeniului de legare/lichidare a ADN-ului lipsit de inserția TOPRIM rezolvată la 4,0 Å a fost de cea mai bună calitate. Aproape toate lanțurile laterale au putut fi văzute și densitatea Gepotidacinei a fost clar vizibilă. Această hartă a fost utilizată pentru a rafina o structură cristalină a domeniului de legare/cleavage a ADN-ului din girasa ADN a E. coli17. Un model atomic dimeric al domeniului de legare/cleavage a ADN-ului a fost generat folosind PDB 3NUH în PyMol (Schrodinger L.L.C.). Modelul atomic ulterior a fost dezbrăcat de aminoacizii aparținând inserției TOPRIM, de toți ionii și de moleculele de apă, cu toate ocupările stabilite la 1 și cu factorii B stabiliți la 50. În primul rând, modelul atomic a fost ajustat cu corpul rigid în harta filtrată și ascuțită cu Chimera61. S-a efectuat o primă rundă de rafinare în spațiu real în PHENIX62 , utilizând ajustarea locală în spațiu real și rafinarea globală de minimizare bazată pe gradient. Apoi, 20 de acizi nucleici din structura ADN-girasei S. aureus41 (PDB 5IWM) au fost copiați și ajustați în modelul nostru atomic. Secvența ADN a fost modificată în conformitate cu ADN-ul utilizat în structura noastră. Reziduurile proteice și acizii nucleici care lipseau au fost construite manual în COOT63. Modelul atomic și dicționarul de constrângeri al gepotidacinei (GSK-2140944) au fost generate cu serverul Grade (http://grade.globalphasing.org). Gepotidacina a fost apoi ajustată manual în densitatea electronică goală în COOT și apoi duplicată. Ambele duplicate au fost setate la o ocupare de 0,5. S-au efectuat mai multe runde de rafinare în spațiu real în PHENIX utilizând restricții pentru structura secundară, rotameri, Ramachandran și simetrie necristalografică, urmate întotdeauna de o inspecție manuală în COOT, până când s-a obținut un model convergent. În cele din urmă, factorii B au fost rafinați printr-o rundă finală de rafinare în spațiu real în PHENIX folosind aceleași setări ca și înainte. După ce rafinarea a fost convergentă, coordonatele atomice ale inserției TOPRIM au fost adăugate la modelul atomic. Acesta a fost rafinat în continuare în reconstrucțiile EM care conțin densitatea inserției în stări închise și predeschise folosind aceeași procedură. S-a efectuat o validare încrucișată pe jumătate de hartă pentru a defini 1,5 ca fiind cea mai bună pondere de rafinare în PHENIX care permite reducerea ciocnirilor atomice și prevenirea supraajustării modelului (Fig. suplimentară 4e). Toate etapele de rafinare au fost efectuate utilizând limita de rezoluție a reconstrucțiilor în conformitate cu criteriul standard de aur FSC-0.14357. Parametrii de rafinare, statisticile modelului și scorurile de validare sunt rezumate în tabelul suplimentar 2. Modelele atomice ale domeniului de legare/lichidare a ADN-ului din E. coli în conformații închise (cu și fără inserție) și de predeschidere au fost depuse în Protein Data Bank sub numerele de acces 6RKU, 6RKS, respectiv 6RKV.
Pentru complexul global, am utilizat o combinație de diferite reconstrucții EM pentru a construi modelul atomic al complexului global al ADN-girasei. Structura ATPase-Core rezolvată la 5,9 Å a fost utilizată pentru a ajusta cu corp rigid în Chimera structura cristalină a domeniului ATPază în complex cu ADPNP32 (PDB 1EI1) și domeniul de legare/cleavage a ADN-ului rafinat în conformație închisă. Calitatea densității electronice a permis construirea în COOT a reziduurilor lipsă ale legăturii dintre domeniul ATPază și domeniul de legare a ADN-ului/cleavage. Structura CTD-Core rezolvată la 6,3 Å a fost utilizată pentru ajustarea precisă a corpului rigid al structurii cristaline β-pinwheel10 în Chimera. Cei 10 aminoacizi lipsă (564-574) care urmează după GyrA-box au fost adăugați cu ajutorul serverului de modelare Phyre264. Calitatea densității electronice a permis construirea în COOT a acizilor nucleici lipsă din jurul roții β, precum și a celor 10 aminoacizi care leagă ultimele reziduuri GyrA de roata β. Pe baza unei preziceri a structurii secundare, o parte a legăturii a fost construită ca o alfa-helix (Fig. 3). Modelul atomic ulterior, care conține domeniul ATPază, domeniul de legare/copilare a ADN-ului și o roată β-pinwheel, a fost ajustat cu corp rigid în structura complexă globală rezolvată la 6,6 Å cu ajutorul Chimera. Apoi, o copie a primei rotițe β a fost ajustată în densitatea celei de-a doua rotițe β în COOT. Acizii nucleici lipsă din jurul celei de-a doua rotițe β, precum și cele 10 reziduuri lipsă ale legăturii au fost construite manual în COOT. Modelul atomic rezultat a fost lipsit de toți ionii și moleculele de apă, cu toate ocupațiile stabilite la 1 și cu factorii B stabiliți la 50. În cele din urmă, rafinarea în spațiu real a modelului atomic în raport cu structura complexă globală a fost realizată în PHENIX, utilizând rafinarea cu corp rigid și minimizarea globală bazată pe gradient. Limita de rezoluție pentru rafinare a fost stabilită în conformitate cu criteriul standard de aur FSC-0.14357. S-au efectuat, de asemenea, validări încrucișate pe jumătate de hartă (Fig. suplimentară 4e). Parametrii de rafinare, statisticile modelului și scorurile de validare sunt rezumate în tabelul suplimentar 2. Modelul atomic al structurii globale a fost depus în Protein Data Bank sub numărul de acces 6RKW. Toate figurile au fost create cu Chimera61, ChimeraX65 și PyMol (Schrodinger L.L.C.).
E. coli GyrB R286K, R286Q, și E264A purificare
PET28b modificat utilizat pentru E. coli de tip sălbatic. coli GyrB de supraexprimare a GyrB a fost mutat prin mutageneză dirijată de situs cu ajutorul kitului QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis (Agilent) pentru a genera trei plasmide care adăpostesc mutațiile R286K, R286Q sau E264A (tabelul suplimentar 4). Procedurile de supraexprimare și purificare pentru cei trei mutanți sunt identice cu cele pentru GyrB de tip sălbatic descrise mai sus în secțiunea Metode.
T. thermophilus GyrB K284R, K284Q purificare
PET28b modificat utilizat pentru GyrB de tip sălbatic din T. thermophilus. thermophilus GyrB overexpression12 a fost mutat prin mutageneză dirijată de situs cu ajutorul kitului QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis (Agilent) pentru a genera două plasmide care adăpostesc mutațiile K284R sau K284Q (tabelul suplimentar 4). Procedurile de supraexprimare și purificare pentru cei doi mutanți sunt identice cu cele pentru GyrB de tip sălbatic din E. coli descrise mai sus în secțiunea Metode.
DNA supercoiling assay
O concentrație crescândă de ADN-girasă (GyrA2B22) a fost incubată la 37 °C cu 6 nM de plasmidă pUC19 relaxată într-un amestec de reacție care conține 20 mM Tris-acetat pH 7,9, 100 mM acetat de potasiu, 10 mM acetat de magneziu, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM ATP, 100 µg/ml BSA. După 30 min, reacțiile au fost oprite prin adăugarea de SDS 1%. S-a utilizat electroforeza pe gel de agaroză pentru a monitoriza conversia pUC19 relaxată în forma supraînfășurată. Probele au fost rulate pe un gel de agaroză 0,8 %, tampon 1X Tris Borat EDTA (TBE), la 6 V/cm timp de 180 de minute la temperatura camerei. Gelurile de agaroză au fost colorate cu 0,5 mg/ml de bromură de etidiu în 1X TBE timp de 15 minute, urmate de 5 minute de decolorare în apă. Topoizomerii ADN au fost evidențiați cu ajutorul unui Typhoon (GE Healthcare).
Dezvoltarea activității ATPazei
Hidroliza ATP se măsoară urmărind oxidarea NADH mediată de piruvat kinaza (PK) și lactat dehidrogenază (LDH). Absorbția a fost monitorizată la 340 nm timp de 600 s la 37 °C cu un spectrofotometru Shimadzu 1700. Reacțiile au fost înregistrate în triplicat cu 50-100 nM de GyrA2B2 și 16 nM de ADN liniar (pCR-blunt) în 500 µl dintr-un tampon care conține 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM acetat de potasiu, 8 mM acetat de magneziu, 7 mM BME, 100 µg/mg de BSA, 4U/5U de amestec PK/LDH, 2 mM PEP și 0,5 μg de BSA.2 mM NADH.
Aliniere multiplă și conservare evolutivă a reziduurilor
Secvențe ale proteinei ATPază/Transducător GyrB din 30 de specii (coduri Uniprot: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens; Q83FD5_COXBU, Coxiella burnetii; GYRB_ECOLI, Escherichia coli; GYRB_NEIGO, Neisseria gonorrhoeae; GYRB_SALTY, Salmonella typhimurium; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa, Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile; GYRB_RICFE, Rickettsia felis; Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis; GYRB_BORBU; Borrelia burgdorferi; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis, GYRB_THEMA, Thermotoga maritima; GYRB_THET8, Thermus thermophilus; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) au fost aliniate cu ajutorul serverului Clustal Omega (EMBL-EBI). Alinierea ulterioară a fost utilizată pentru a trasa conservarea evolutivă a aminoacizilor pe structura ATPase/transductor (PDB ID 1EI1) folosind serverul ConSurf (http://consurf.tau.ac.il). Arborele filogenetic a fost generat prin metoda de alăturare a vecinilor folosind alinierea multiplă în Clustal Omega.
Rezumat de raportare
Informații suplimentare cu privire la designul cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare Nature Research legat de acest articol.
.