APL oferă servicii de analiză pe gel nativ din 1998. În prezent, multe laboratoare ignoră, din păcate, acest instrument valoros, deoarece consideră că gelurile native sunt pur și simplu prea greu de utilizat sau deoarece cred în mod eronat că pot fi utilizate numai cu proteine acide. La Alliance Protein Laboratories efectuăm în mod curent geluri native atât pe proteine bazice, cât și pe proteine acide. Am fi bucuroși să analizăm probe pentru dumneavoastră și/sau să lucrăm cu dumneavoastră pentru a dezvolta un protocol de utilizare în laboratorul dumneavoastră.
Ce este un gel nativ?
Electroforeza pe gel „nativ” sau „nedenaturant” se efectuează în absența SDS. În timp ce în SDS-PAGE mobilitatea electroforetică a proteinelor depinde în primul rând de masa lor moleculară, în PAGE nativ mobilitatea depinde atât de sarcina proteinei, cât și de dimensiunea sa hidrodinamică.
Carcina electrică care conduce electroforeza este guvernată de sarcina intrinsecă a proteinei la pH-ul tamponului de funcționare. Această sarcină va depinde, bineînțeles, de compoziția de aminoacizi a proteinei, precum și de modificările post-translaționale, cum ar fi adăugarea de acizi sialici.
Din moment ce proteina își păstrează conformația pliată, dimensiunea sa hidrodinamică și mobilitatea pe gel vor varia, de asemenea, în funcție de natura acestei conformații (mobilitate mai mare pentru conformații mai compacte, mai mică pentru structuri mai mari, cum ar fi oligomerii). Dacă PAGE nativ este efectuat în apropierea pH-ului neutru pentru a evita denaturarea acidă sau alcalină, atunci poate fi utilizat pentru a studia conformația, autoasocierea sau agregarea și legarea altor proteine sau compuși.
Astfel, gelurile native pot fi sensibile la orice proces care modifică fie sarcina, fie conformația unei proteine. Acest lucru îi face instrumente excelente pentru a detecta lucruri precum:
-
modificări ale sarcinii datorate degradării chimice (de ex. deamidarea)
-
conformații neîndoite, „globule topite” sau alte conformații modificate
-
oligomeri și agregate (atât covalente cât și necovalente)
-
evenimente de legare (proteină-proteină sau proteină-ligand)
Aceste proprietăți, și randamentul lor relativ ridicat, fac din gelurile native instrumente excelente pentru analizarea probelor de stabilitate accelerată, pentru demonstrarea comparabilității diferitelor loturi sau procese sau pentru examinarea efectelor excipienților.
Un alt avantaj al gelurilor native este acela că este posibil să se recupereze proteinele în starea lor nativă după separare. Cu toate acestea, recuperarea materialelor biologice active poate fi necesară înainte de orice fixare sau colorare.
Rețineți că gelurile native despre care se discută aici sunt acum numite uneori geluri „native clare”. Ele diferă în principiu de așa-numitele geluri „native albastre”, care depind de legarea unui colorant pentru a conferi proteinei o sarcină electrică foarte mare, care copleșește sarcina intrinsecă a polipeptidei. Dacă se presupune că cantitatea de colorant legată este proporțională cu masa proteinei, atunci mobilitatea observată cu ajutorul acestui protocol „nativ albastru” poate fi utilizată pentru a estima masa molară prin comparație cu standardele proteice, la fel cum se procedează în cazul SDS-PAGE. Standardele de masă vândute pentru a fi utilizate cu gelurile „blue native” nu pot fi folosite pentru a estima masele molare pentru adevăratele geluri native care sunt discutate aici.
.