Subiecți
Acest studiu a implicat 88 de pacienți cu LC naivi de tratament fără metastaze la distanță. Toți pacienții au fost diagnosticați cu carcinom laringian cu celule scuamoase prin examinarea patologică a probelor și au fost tratați la Departamentul de Otorinolaringologie, Chirurgie a capului și gâtului, Universitatea din Ryukyus, între ianuarie 2008 și decembrie 2017. Prognosticul final al pacienților a fost judecat în iulie 2018. Clasificarea stadiului tumorii, ganglionului, metastazelor (TNM) a fost efectuată în conformitate cu Manualul de stadializare AJCC (ediția a 7-a). Pentru a determina stadiul clinic și pentru a detecta cancerele primare multiple concomitente, pacienții au fost supuși unor examinări fizice și endoscopice ale tractului gastrointestinal superior, inspecției cu ultrasunete a gâtului, tomografiei computerizate (CT) și imagisticii CT cu emisie de pozitroni cu 18F-fluorodeoxiglucoză.
Acest studiu a fost aprobat de către Comitetul de evaluare instituțională al Universității Ryukyus și a fost efectuat în conformitate cu Declarația de la Helsinki din 1975, revizuită în 2008. Consimțământul în cunoștință de cauză a fost obținut de la toți pacienții cu LC înainte de înrolare.
Tratament
Tratamentul principal pentru leziunea primară cu intenție curativă a fost radioterapia convențională (RT) singură sau rezecția cu laser în T1, chimioradioterapia concomitentă (CCRT) în T2, CCRT sau intervenția chirurgicală în T3 și intervenția chirurgicală în T4, indiferent de prezența HPV. Leziunile ganglionare au fost gestionate cu CCRT sau cu disecția gâtului combinată cu rezecția leziunii primare. Toți pacienții care au primit RT (doza totală, 70 Gy) au beneficiat de planificare tridimensională a radioterapiei asistată de CT în poziția de tratament cu imobilizare cu mască. Protocolul pentru CCRT a fost cel raportat anterior . Atunci când tumora primară în T3 nu a prezentat un răspuns parțial, indiferent de răspunsul ganglionilor limfatici de la nivelul gâtului la o iradiere de 39,6 Gy, pacienții au fost supuși unei intervenții chirurgicale curative pentru leziunea primară combinată cu disecția gâtului.
Detecția statutului HPV și imunohistochimia p16
Toate probele de țesut de la leziunile primare fără iradiere sau chimioterapie au fost analizate cu reacția în lanț a polimerazei (PCR) pentru detectarea ADN HPV folosind probe proaspete congelate, care au fost obținute la biopsie sau rezecție chirurgicală, și imunohistochimia p16 folosind probe FFPE. Cazurile cu rezultate negative de detectare a HPV la PCR și supraexpresie p16 (≥75% celule pozitive și o intensitate de colorare cel puțin moderată) au fost evaluate în continuare pentru statusul HPV cu ajutorul hibridizării in situ (ISH) cu sonde de ADN HPV (ADN ISH) . PCR cantitativă în timp real (qPCR) pentru încărcătura virală și starea fizică, așa cum este descrisă mai jos, a fost efectuată în cazurile care găzduiesc HPV-16 .
PCR pentru detectarea ADN HPV
În scurt, ADN-ul a fost izolat din probele de tumori folosind un kit Gentra Puregene Tissue Kit (QIAGEN, Germantown, MD). Prezența și integritatea ADN-ului au fost verificate în toate probele prin amplificarea prin PCR a genei β-globinei cu ajutorul primerilor PC04 și GH20 . Seturile de amorse consensuale generale GP5+/GP6+ și MY09/MY11 au fost utilizate pentru a analiza prezența ADN-ului HPV prin PCR (tabelul 1), așa cum a fost descris anterior . În plus, probele de ADN negative pentru PCR GP5+/GP6+ sau MY09/MY11 au fost reamplificate din nou cu ajutorul unei abordări nested PCR cu perechea de primer GP5+/GP6+ . Produsele PCR de dimensiunea așteptată (GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp) au fost purificate și secvențiate direct cu un analizor genetic ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, Foster City, CA). Secvențele au fost aliniate și comparate cu ajutorul programului BLAST cu cele ale tipurilor cunoscute de HPV din baza de date GenBank.
Imunohistochimie p16
Imunohistochimia pentru p16 a fost realizată cu ajutorul kitului histologic CINTec® p16 (MTM Laboratories; Roche Applied Sciences, Penzberg, Germania) în conformitate cu protocolul producătorului . Imunomarcajul a fost vizualizat prin incubare în 3,3′-diaminobenzidină, iar lamelele colorate au fost contracolorate cu hematoxilină.
Criteriile de scor pentru imunoreactivitatea p16 utilizate în prezentul studiu au fost următoarele: 0, nicio colorație; 1, 1 – < 25% din celulele tumorale pozitive pentru p16; 2, 25 – < 50% pozitive; 3, 50 – < 75% pozitive; 4, ≥75% pozitive și o intensitate slabă a colorației; și 5, ≥75% pozitive și o intensitate cel puțin moderată a colorației. Termenul de „supraexpresie p16” (p16-pozitiv) a fost definit ca fiind un scor de 5 în prezentul studiu.
ISH cu sonde ADN HPV
S-a efectuat ISH pe bază de biotinil-tiramidă utilizând sonda ADN biotinilată GenPoint™ HPV și sistemul de amplificare a semnalului GenPoint-tiramidă pentru sonde biotinilate în conformitate cu protocolul producătorului (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Sonda GenPoint HPV ADN biotinilat reacționează cu tipurile de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 și 68 în secțiuni de 4 μm grosime ale probelor FFPE. Detectarea sondei hibridizate a fost realizată cu ajutorul sistemului de detecție GenPoint, în conformitate cu protocolul producătorului, cu streptavidină primară-peroxidază de hrean (HRP) inclusă, biotinil-tiramidă, streptavidină-HRP secundară și 3,3′-diaminobenzidină l (Dako; Agilent Technologies). Lamele au fost contracolorate cu hematoxilină.
Estimarea încărcăturii virale și a stării fizice a HPV-16 prin qPCR
Pentru a evalua încărcătura virală și starea fizică a HPV-16, qPCR a fost efectuată așa cum a fost descrisă anterior . Pe scurt, s-au utilizat amorse și sonde TaqMan care au vizat cadrele de lectură deschise E2 și E6 ale HPV-16 (tabelul 1). Amorsele și sondele recunosc regiunea balama E2, care este ștearsă la integrarea HPV-16. Două curbe standard pentru genele E2 și E6 au fost create prin amplificarea unor diluții în serie de 10 ori (101, 102, 103, 104, 105 și 106 copii virale) ale plasmidului pB-actin early, care a fost un cadou de la Karl Munger și care poartă regiunea completă a genei timpurii a HPV-16 (plasmidă Addgene nr. 13711; Addgene, Cambridge, MA). Sarcina ADN viral a fost evaluată prin calcularea numărului de copii E6. O curbă standard externă a fost creată folosind diluții seriale cunoscute (0,3, 3, 30 și 300 ng) de ADN genomic uman placentar (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germania) pentru cuantificarea ADN-ului celular, iar β-globina a fost amplificată așa cum s-a descris anterior. Cantitatea de ADN a fost calculată prin reprezentarea grafică a valorilor Cq în raport cu logaritmul curbei standard. Starea fizică a HPV-16 a fost evaluată pe baza unei metode publicate anterior . Un raport E2/E6 ≥ 1 indică predominanța formei episomale, în timp ce un raport număr de copii E2/număr total de E6 < 1 indică prezența atât a formei integrate, cât și a celei episomale (formă mixtă).
Detecția expresiei ARNm E6 prin qPCR și ARN ISH la pacienții HPV-16-pozitivi cu supraexpresie p16
Expresia ARNm E6 a fost detectată în probele de la pacienții identificați ca fiind HPV-16-pozitivi cu supraexpresie p16. ARN total a fost extras din țesuturile congelate cu ajutorul RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Japonia) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. ARN-ul total (500 ng) a fost utilizat pentru a sintetiza ADNc de primul șir cu ajutorul unui kit de reactivi PrimeScript™ RT Reagent Kit cu gDNA Eraser (Perfect Real Time; Takara Bio) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pentru a măsura expresia ARNm HPV-16 E6, s-a efectuat qPCR utilizând sistemul de detecție PCR în timp real CFX96 Touch™ (Bio-Rad, Hercules, CA) și TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). S-au utilizat amorse și sonde TaqMan (tabelul 1) care vizează gena HPV-16 E6 și gena β-actina . Sonda β-actină a fost marcată cu FAM la capătul 5′ și cu TAMRA la capătul 3′ (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japonia). Condițiile de amplificare au fost: 2 min la 50 °C, 10 min la 95 °C și un ciclu în 2 etape de 95 °C timp de 15 s și 60 °C timp de 60 s pentru un total de 40 de cicluri. S-au generat două curbe standard pentru genele E6 ș i β-actina prin amplificarea unor diluții în serie de 10 ori (101, 102, 103, 104, 105 ș i 106 copii) ale plasmidei pB-actin early ș i ale plasmidei pCAG-mGFP-actin, care a fost un cadou de la Ryohei Yasuda, purtând regiunea codificatoare completă a β-actinei (plasmidă Addgene nr. 21948; Addgene). Expresia genei E6 în fiecare probă a fost normalizată prin cantitatea de control intern β-actina.
RNA ISH pentru ARNm HPV-16/- 18 E6/E7 a fost realizat cu ajutorul unui kit de reactivi RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pe scurt, secțiuni seriale cu grosimea de 4 μm din probele FFPE au fost deparafinate în xilen și rehidratate folosind o serie de alcool gradat. Peroxidaza endogenă a fost blocată cu reactivul RNAscope® Hydrogen Peroxide Reagent la temperatura camerei timp de 10 minute. Recuperarea ARN-ului țintă HPV a fost efectuată în RNAscope® Target Retrieval Reagent la 100 °C timp de 15 min. Lamele au fost digerate cu RNAscope® Protease Plus la 40 °C timp de 30 min. Sonda de ARN HPV-16/- 18 E6/E7 (RNAscope® Probe-HPV16/18) a fost adăugată pe secțiuni și s-a aplicat o lamelă de acoperire. Lamele au fost transferate într-o cameră umidificată pentru hibridizare la 40 °C timp de 2 h. Apoi, lamelele au fost îndepărtate, iar lamelele au fost spălate cu RNAscope® Wash Buffer Reagent la 40 °C. Amplificarea semnalului a fost realizată în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Detectarea sondei hibridizate s-a realizat cu ajutorul 3,3′-diaminobenzidinei (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit). Lamele au fost contracolorate cu hematoxilină. Lamele de control pozitiv (celule HeLa care exprimă ARNm HPV-18 E6/E7) au fost incluse în RNA ISH. Colorația pozitivă a fost identificată ca puncte punctate maro observate în nucleu și/sau citoplasmă.
Analiză statistică
Testul chi-pătrat al lui Pearson a fost utilizat pentru a compara caracteristicile pacienților cu LC în funcție de ADN HPV și de statutul de supraexpresie p16. Supraviețuirea cumulativă (CS) a fost calculată prin metoda Kaplan-Meier și a fost comparată între două grupuri cu ajutorul testului log-rank. Toate analizele au fost efectuate cu ajutorul pachetului statistic SPSS (SPSS, versiunea 25.0; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). P < 0,05 a fost considerat semnificativ.