PMC

ANUNȚ DESPRE GENOMĂ

Escherichia coli BL21 și BL21(DE3), create de F. William Studier și Barbara A. Moffatt (1), sunt tulpini comune de laborator pentru producerea de proteine recombinate. Lipsa proteazelor lon și ompT, considerate adesea ca fiind caracteristici comune în rândul liniei B, a determinat dezvoltarea acestor tulpini pentru gazde de exprimare a proteinelor. E. coli BL21(DE3), un derivat al BL21, este probabil cel mai utilizat pe scară largă în exprimarea la nivel înalt a proteinelor recombinante și găzduiește un profagiu DE3 derivat dintr-un bacteriofag λ, care poartă gena ARN polimerazei T7 sub controlul promotorului lacUV5. E. coli BL21 a fost utilizat în mod obișnuit pentru expresia non-T7 și a fost, de asemenea, modificat recent pentru a produce un vaccin cu ADN plasmidic, datorită performanțelor sale mai bune în culturile în loturi hrănite cu densitate mare de celule în comparație cu tulpinile K-12 (2).

Secvența genomului E. coli BL21(DE3) a fost determinată anterior de institutul nostru (3). În principiu, secvența genomului BL21 ar fi identică cu cea a BL21(DE3), cu excepția profagului DE3. Cu toate acestea, pot apărea variații de la un stoc la altul care pot avea implicații grave pentru experimente (4). Având ca referință informațiile despre genomul E. coli BL21(DE3), secvența completă a genomului BL21 a fost construită folosind doar secvențierea de generație următoare și au fost identificate diferențele genomice bază cu bază.

Steaua E. coli BL21 a fost achiziționată de la TaKaRa Bio (număr de cod 9126, număr de lot K142). Secvențierea genomului a fost efectuată la Human Derived Material Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), cu ajutorul sistemului Illumina HiSeq 2000. Secvența completă a genomului BL21 a fost obținută atât prin cartografiere de referință elaborată, cât și prin asamblarea de novo a citirilor Illumina de 101 nt (47 123 524 de citiri împerecheate dintr-o bibliotecă de ~150 bp), utilizând CLC Genomics Workbench versiunea 6.5.1 (CLC bio).

Ne așteptam ca o secvență modificată a genomului BL21(DE3) (CP001509.3) – din care a fost eliminată regiunea profagică, lăsând o singură copie a situsului de atașare lambda (attB) – să servească drept cea mai bună secvență de referință. Cu toate acestea, analiza de acoperire din prima cartografiere a arătat că attB din BL21 nu era gol, ci ocupat de un profagiu λ*B cu o lungime de 12,1 kb, la fel ca în E. coli REL606 (3), care a fost raportat ca fiind o caracteristică comună în rândul liniei B (5). O a doua încercare de cartografiere de referință, folosind o secvență modificată având o secvență de profagiu λ*B, a dezvăluit o altă regiune cu acoperire redusă între gena ybhC și limita stângă a situsului de atașare lambda, attL. Prin compararea secvențelor, cea mai bună secvență de potrivire a fost identificată din contigurile asamblate de novo și a fost cu 23 pb mai lungă decât regiunea corespunzătoare din BL21(DE3). S-a pregătit apoi o secvență de referință actualizată prin înlocuirea regiunii cu acoperire redusă și a vecinului său (~200 pb) și s-a efectuat din nou cartografierea. Acoperirea uniformă a citirilor pe întreaga secvență de referință finală a fost confirmată prin investigație vizuală și nicio altă diferență nu a fost găsită prin detectarea SNV/variație structurală bazată pe calitate sau prin analiza punctelor de ruptură. Asamblarea cu ajutorul citirilor fără cartografiere nu a avut ca rezultat niciun contig care să susțină prezența unor regiuni specifice BL21. Adnotarea genomului a fost realizată prin serviciul NCBI Prokaryotic Genome Automatic Annotation Pipeline (PGAAP).

.