COMENTARIU
Excluderea colorantului este o tehnică simplă și rapidă de măsurare a viabilității celulare, dar este supusă problemei că viabilitatea este determinată indirect din integritatea membranei celulare. Astfel, este posibil ca viabilitatea unei celule să fi fost compromisă (măsurată prin capacitatea de a crește sau de a funcționa), chiar dacă integritatea membranei sale este (cel puțin tranzitoriu) menținută. Invers, integritatea membranei celulare poate fi anormală, dar celula poate fi capabilă să se repare și să devină pe deplin viabilă. O altă problemă potențială este aceea că, deoarece absorbția de colorant este evaluată în mod subiectiv, cantități mici de absorbție de colorant care indică o leziune celulară pot trece neobservate. În acest sens, excluderea colorantului efectuată cu un colorant fluorescent folosind un microscop cu fluorescență duce în mod obișnuit la marcarea mai multor celule neviabile cu absorbție de colorant decât testele efectuate cu albastru trypan folosind un microscop cu transmisie.
O metodă mai sofisticată de măsurare a viabilității celulare este determinarea excluderii colorantului prin citometrie de flux. Acest lucru se poate face folosind albastru de tripan, deoarece această proteină se leagă de proteine și apoi emite un semnal de fluorescență care poate fi detectat într-un citometru de flux (la 660 nm atunci când este legat de albumina serică bovină) (a se vedea referința 2 pentru detalii privind utilizarea albastru de tripan în citometria de flux). Alternativ, excluderea poate fi măsurată cu alți coloranți emițători de lumină, cum ar fi iodura de propidiu (a se vedea unitatea 5.4 pentru o descriere a utilizării iodurii de propidiu evaluarea viabilității celulare prin analiza citometrică în flux). Caparisonarea detaliată a estimărilor de celule vii față de celulele moarte folosind excluderea cu albastru trypan evaluată manual, așa cum este descrisă aici, și evaluată electronic prin citometrie de flux indică faptul că cele două tehnici oferă rezultate foarte asemănătoare în mâini experimentate. În timp ce tehnica de excludere a colorantului descrisă este mai susceptibilă de a conduce la erori din cauza subiectivității operatorului, abordarea citometrică în flux este mai puțin potrivită pentru evaluarea viabilității celulelor în timpul efectuării unor tehnici de purificare celulară complexe și consumatoare de timp. Astfel, o tehnică citometrică în flux este aplicabilă numai atunci când trebuie obținute măsurători precise ale numărului de celule moarte dintr-un amestec de celule.
Recent, a fost raportat un „test automatizat de viabilitate la microscopul cu fluorescență” în care viabilitatea celulară folosind iodura de propidiu împreună cu un dispozitiv care numără celulele vii și moarte într-un contor de celule microscopice portabil echipat cu un microcip. Se spune că acest contor este capabil să evalueze viabilitatea celulară mai rapid decât tehnica manuală descrisă aici sau decât citometrul de flux și să obțină numărători mai precise și mai fiabile. Acest dispozitiv poate fi util în situațiile în care sunt necesare mai multe teste de viabilitate celulară achiziționate rapid (3).
De reținut că viabilitatea celulară poate fi, de asemenea, evaluată cu coloranți care se leagă de ADN (monoazidă de etidiu), agenți care se leagă de fosfatidilserină (Annexin V) și coloranți reactivi cu amine. Utilizarea acestor agenți alternativi necesită, de obicei, citometrie în flux și, prin urmare, este aplicabilă numai în condiții speciale.
Excluderea cu albastru de tripan, așa cum este descrisă în protocolul de mai sus, poate fi realizată în 5 până la 10 min.
.