PMC

Prezentare caz

Raportul de caz de față provine dintr-o vizită veterinară de rutină la o fermă de 155 de animale, cu două rase de ovine (Pelifolk și Blackbelly), situată în Tesistán, municipalitatea Zapopan, statul Jalisco, Mexic. Instalațiile din această fermă au fost adaptate de la o fermă de porci anterioară și sunt încă înconjurate de ferme de porci și bovine în vecinătatea apropiată. Efectivul a fost ținut pe podele ridicate pentru a facilita curățarea și manipularea, însă în boxe erau prezente multe obiecte ascuțite prăjite (cum ar fi sârmă, garduri rupte, cuie etc.), iar curățarea nu era efectuată în mod corespunzător în fermă la momentul inspecției. Hrănirea se baza pe furajele disponibile la nivel local, cum ar fi: furaje grosiere de slabă calitate, gunoi de grajd de porc și furaje concentrate cu conținut ridicat de proteine din comerț. Această fermă a apelat la serviciile veterinare din cauza abceselor cutanate frecvente constatate la animale; nu au fost raportate alte plângeri legate de probleme cutanate. Abcesele nu par să afecteze productivitatea animalelor, însă prezența unor astfel de leziuni afectează în mod negativ comercializarea animalelor și, prin urmare, proprietarul a fost interesat să afle agentul etiologic și tratamentul recomandat pentru a elimina boala din fermă. Conținutul abceselor a fost prelevat de la 31 de animale (29 de oi, 1 berbec și 1 miel) de către un medic veterinar atestat și trimis la laborator pentru diagnostic bacteriologic, în vederea găsirii agenților etiologici care au cauzat problema. Pe baza aspectului abceselor, diagnosticul prezumtiv al infecției din fermă a fost Limfadenita cazeoasă pentru majoritatea animalelor . Cu toate acestea, analiza bacteriologică a demonstrat că 13 animale au fost infectate cu C. pseudotuberculosis, 1 cu Corynebacterium spp., 2 cu Proteus spp., 2 cu Streptococcus spp., iar în restul de 13 cazuri agentul patogen nu a putut fi identificat. Categorizarea pentru izolatul de Corynebacterium spp. a fost neclară deoarece rezultatele testelor bacteriologice și biochimice nu au fost concludente.

Acest articol descrie izolarea de C. xerosis de la un miel Pelifolk (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) în vârstă de 4 luni, în vârstă de 4 luni, în stare corporală bună. După cunoștințele noastre, acesta este primul raport pentru C. xerosis care produce un abces cutanat clinic la ovine. A fost obținut consimțământul în cunoștință de cauză de la proprietarul animalului pentru publicarea rezultatelor studiului clinic, inclusiv a materialului fotografic. Animalul a prezentat un abces de consistență dură, fără drenaj, pe partea stângă a gâtului (Fig. 1a). Diagnosticul clinic inițial a sugerat o limfadenită cazeoasă, posibil cauzată de C.pseudotuberculosis. O probă pentru analiza bacteriologică a fost obținută prin puncția abcesului cu o seringă sterilă, de 5 ml, cu un ac hipodermic de calibru 20, după ce s-a curățat și dezinfectat suprafața abcesului. Tipul de exsudat recuperat a fost de tip seros și cu aspect alb. Proba biologică a fost păstrată la 4 °C până la caracterizarea biologică la Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, km 15,5 Toluca-Atlacomulco road, Toluca, Mexico, z.c. 50200). Timpul dintre prelevare și procesare nu a depășit 72 h. Proba a fost cultivată în dublu exemplar, în agar 8 % sânge de oaie și incubată 24-48 h la 37 °C în condiții aerobe și microaerofile . Au fost observate colonii cu diametrul de 1,0 mm, nehemolitice, de culoare brun-gălbuie și cu aspect ușor uscat (Fig. 2a). Aceste caracteristici morfologice nu corespundeau cu cele descrise anterior pentru C. pseudotuberculosis, ci mai degrabă păreau colonii de C. xerosis . Microscopic (mărire 10×; Fig. 2c), bacteriile au fost observate ca niște bastonașe Gram-pozitive pleomorfe, pleomorfe, cu colorație neregulată, terminate în formă de club. Testele biochimice au arătat următoarele rezultate: Fier triplu zahăr (TSI,-), Agar de fier lizină (LIA,-), Testul citratului (CIT,-), Sulfură Indol-Motilitate (SIM,-), Motilitate, Indol, Ornitină (MIO,-), Oxidativ-fermentativ (OF,-) Roșu de metil (-), apă peptonată (-), Voger Pascaguer (-), uree (-), bulion de nitrați (+), trehaloză (+), zaharoză (+), maltoză (+) și fermentația glucozei (pozitivă la 37 °C și negativă la 42 °C). Aceste rezultate ar putea corespunde unui profil de C. pseudotuberculosis, cu excepția testului de uree, care a fost negativ în loc de pozitiv și, prin urmare, coincide mai bine cu un profil de C. xerosis . Rezultatele diagnosticului nu au fost concludente, prin urmare, chiar dacă sistemul API nu este specific pentru a identifica C. xerosis , am decis să studiem izolatul cu acest sistem, pentru a vedea dacă acest izolat ar putea fi identificat ca fiind o altă specie de Corynebacterium. În plus, pentru a afla dacă acest izolat aparține altor specii, cum ar fi C. freneyi și C. amycolatum, care pot fi rar întâlnite la ovine, am testat dacă colonia a fost capabilă să crească la 20 °C și dacă a fost capabilă să fermenteze glucoza la 42 °C. Izolatul a crescut bine la 20 °C și nu a fermentat glucoza la 42 °C, ambele caracteristici asociate cu C. xerosis și C. hansenii, prin urmare am decis să efectuăm o analiză moleculară pentru a afla dacă putem identifica molecular izolatul ca fiind C. xerosis. Am analizat trei loci pentru a crește precizia diagnosticului nostru. Am testat o genă absentă în mod normal la C. xerosis, dar prezentă la C. pseudotuberculosis, gena pld, unde ne așteptam să nu găsim niciun amplicon după testul PCR dacă izolatul era C. xerosis, spre deosebire de C. hanseni. pseudotuberculosis, care va amplifica o bandă de 203 pb; un al doilea locus a vizat amplificarea regiunii de spațiere intergenică a genelor ARNr 16S-23S (16S-23S), utilizând primeri concepuți pentru C. pseudotuberculosis, despre care s-a raportat că nu funcționează pentru C. xerosis , și ne-am aștepta, de asemenea, la nicio bandă de amplificare pentru C. xerosis și la o bandă de 816 pb pentru C. pseudotuberculosis. În cele din urmă, am efectuat amplificarea PCR și secvențierea genei rpoB (446 bp), care a fost raportată anterior pentru a diferenția speciile de Corynebacterium . Extracția ADN a fost efectuată cu ajutorul unui kit comercial (KAPA Express Extract), conform protocolului producătorului. S-a realizat o tehnică Multiplex-PCR pentru amplificarea secvențelor parțiale ale genelor pld, 16S-23S și rpoB, utilizând protocolul publicat de Pacheco în 2007 . Reacțiile au fost efectuate cu ajutorul unui kit comercial de PCR multiplex (QIAGEN Multiplex PCR) în conformitate cu specificațiile producătorului. Analiza PCR a inclus următoarele probe: Izolatul care urmează să fie caracterizat, izolatul putativ C. xerosis și două tulpini de C. pseudotuberculosis (un izolat local caracterizat anterior ca biovar ovis și, o tulpină de referință, ATCC 43924, biovar equi) utilizate ca martori. Așa cum era de așteptat pentru C. xerosis putativ, a fost amplificată o singură bandă de amplicon PCR de 446 bp, care corespunde fragmentului genei rpoB, iar fragmentele genei intergenice 16S-23S și ale genei pld nu au fost amplificate. De asemenea, așa cum era de așteptat, ambele tulpini de C. pseudotuberculosis au prezentat trei benzi de 203, 446 și 816 bp, corespunzătoare genelor pld, rpoB și, respectiv, 16S (Fig. 3). Ampliconii genei RpoB din toate cele trei probe au fost purificați cu ajutorul kitului de purificare Promega (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) și au fost trimiși pentru secvențiere automată de către Macrogen (Rockville, MD, SUA). Alinierile de secvențe multiple obținute în urma unui BLAST (NCBI) au fost analizate împreună cu secvențele izolatelor noastre folosind analiza Clustal W din Mega 6.0.6 (Fig. 4). Analiza filogenetică a fost efectuată utilizând metoda de îmbinare a vecinilor (software-ul MEGA 6.0.6). Valorile bootstrap au fost obținute prin generarea a 1000 de arbori aleatori. Analiza filogenetică a inclus, de asemenea, secvențele din gena rpoB de la C. xerosis (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculosis biovar ovis (GenBank CP002924.1) și C. pseudotuberculosis biovar equi (GenBank CP003540.2). A fost posibil să se observe diferite grupuri filogenetice care corespund anumitor specii de Corynebacterium. Aceste rezultate, confirmă faptul că izolatul din acest studiu (rpoB C53) este C. xerosis (Fig. 4).

Tehnicile de genotipare, cum ar fi PCR, precum și analiza secvenței rpoB a izolatului rpoB C53 din acest studiu, au contribuit în mare măsură la o identificare corectă a speciei, care inițial era înșelătoare atunci când se foloseau caracteristicile fenotipice microscopice și biochimice. Corynebacterium xerosis a fost raportată anterior în eșantioane clinice de cazuri umane în leziuni din endocardite, pneumonite, osteomielite și infecții cutanate, în special la pacienții imunocompromiși . De asemenea, a fost găsită în probe clinice de animale, de exemplu, în leziuni hepatice de capră (suspiciune de pseudotuberculoză) și în laptele de vacă, de la animale care prezentau mastită. La porci, C. xerosis a fost izolat din leziuni din diferite țesuturi, cum ar fi ficatul, rinichii, plămânii, splina, articulațiile, precum și din abcese subcutanate. În plus, C. xerosis a fost izolat din probe clinice de uter la ovine, într-un caz de avort, și din țesuturi pulmonare, de la animale care prezentau probleme respiratorii. Aceste izolate au fost identificate și caracterizate prin amplificarea genei rRNA 16S-23S cu ajutorul PCR-RFLP. Cu toate acestea, în aceste studii, nu a fost posibil să se obțină un model de benzi suficient de clar pentru a diferenția C. xerosis de alte specii de Corynebacterium. Autorii au efectuat, de asemenea, o analiză și o comparație a secvenței genelor 16S și rpoB, care le-a permis să diferențieze C. xerosis de alte specii, similare din punct de vedere genetic cu Corynebacterium .

După cum s-a menționat mai sus, acest studiu a fost realizat pe baza prezenței genei rpoB, care a fost raportată de alți autori ca fiind gena de elecție pentru analiza filogenetică a genului Corynebacterium, deoarece prezintă un polimorfism ridicat, chiar mai mare decât regiunea spacerului intergenic al genelor 16S-23S ARNr . Este cunoscut faptul că abcesele cutanate la ovine (limfadenita cazeoasă) sunt cauzate de C. pseudotuberculosis, iar principalul său factor de virulență și patogenitate este exotoxina fosfolipază D, codificată de gena pld și exprimată în membrana celulară a bacteriei . Această exotoxină este un factor de permeabilitate care favorizează hidroliza legăturilor esterice din sfingomielina din membranele celulelor mamiferelor, contribuind, probabil, la răspândirea bacteriilor de la locul inițial de infecție la locurile secundare prin sistemul limfatic până la ganglionii regionali, și pare să fie implicată în reducerea viabilității macrofagelor în urma infecției . Exotoxina provoacă, de asemenea, leziuni dermonecrotice . Cu toate acestea, această exotoxină nu a fost raportată la C. xerosis ca fiind o toxină patogenă care ar putea contribui la dezvoltarea abceselor. Acest lucru evidențiază importanța efectuării unor cercetări suplimentare cu privire la mecanismele de infecție prezente în această specie de Corynebacterium.

Un punct major de discuție de natură epidemiologică, include faptul că sistemul de producție ovină, de unde a fost obținută proba, a fost folosit anterior pentru porcine, o specie în care C. xerosis a fost raportată ca un agent patogen comun . Mai mult decât atât, unul dintre principalele ingrediente ale dietei ovinelor include subproduse de porc (gunoi de grajd-sămânță de porc), care ar putea avea în cele din urmă agenți patogeni activi, poate inclusiv Corynebacterium spp. În plus, obiectele ascuțite, cum ar fi tije metalice, cuie și sârme, sunt răspândite în toate instalațiile, ceea ce sporește șansele de rănire a animalelor, deschizând o cale de intrare a Corynebacterium spp. în organism, inclusiv C. xerosis. Este posibil ca toți acești factori să fi contribuit la prezența C. xerosis în interiorul instalației. Nu au fost efectuate studii suplimentare, însă recomandările pentru proprietar au fost de a debrida și dezinfecta abcesele de la toate animalele, într-o zonă care să nu conțină infecții (pentru a evita răspândirea agenților patogeni), de a consolida curățarea țarcurilor și de a îndepărta toate marginile și obiectele ascuțite de pe garduri, hrănitori și podele. Deoarece C. xerosis, precum și C. pseudotuberculosis, sunt microorganisme cu potențial zoonotic, fermierului i s-au făcut recomandări de a lua măsuri de precauție extreme în timpul manipulării animalelor și a deșeurilor produse de fermă pentru a preveni infectarea oamenilor și animalelor și posibila răspândire a microorganismului în alte ferme.

.