O abordare pentru prevenirea PD-urilor constă în optimizarea fizico-chimică a sistemului PCR, adică modificarea concentrațiilor de primeri, clorură de magneziu, nucleotide, puterea ionică și temperatura reacției. Această metodă este oarecum limitată de caracteristicile fizico-chimice care determină, de asemenea, eficiența amplificării secvenței țintă în PCR. Prin urmare, reducerea formării PD-urilor poate duce, de asemenea, la reducerea eficienței PCR. Pentru a depăși această limitare, alte metode urmăresc să reducă doar formarea PD-urilor, inclusiv proiectarea amorselor și utilizarea unor sisteme enzimatice sau reactivi PCR diferiți.
Software de proiectare a amorselorEdit
Software-ul de proiectare a amorselor utilizează algoritmi care verifică potențialul de formare a structurii secundare a ADN-ului și de aneantizare a amorselor la sine sau în cadrul perechilor de amorsă. Parametrii fizici care sunt luați în considerare de software sunt potențialul de autocomplementaritate și conținutul de GC al amperelor; temperaturile de topire similare ale amperelor; și absența structurilor secundare, cum ar fi buclele de tulpină, în secvența țintă de ADN.
PC de pornire la caldREdit
Pentru că amperele sunt proiectate pentru a avea o complementaritate scăzută una față de cealaltă, ele se pot aneantiza (etapa I din figură) numai la temperaturi scăzute, de exemplu la temperatura camerei, cum ar fi în timpul preparării amestecului de reacție. Deși ADN polimerazele ADN utilizate în PCR sunt cele mai active în jurul valorii de 70 °C, acestea au o anumită activitate de polimerizare și la temperaturi mai scăzute, ceea ce poate determina sinteza de ADN din amorse după aneantizare una față de cealaltă. Au fost elaborate mai multe metode pentru a preveni formarea PD-urilor până când reacția atinge temperatura de lucru (60-70 °C), iar acestea includ inhibarea inițială a ADN-polimerazei sau separarea fizică a componentelor reacției până când amestecul de reacție ajunge la temperaturi mai ridicate. Aceste metode sunt denumite PCR cu pornire la cald.
Cera: în această metodă, enzima este separată spațial de amestecul de reacție prin ceară care se topește atunci când reacția atinge o temperatură ridicată.
Liberare lentă a magneziului: ADN polimeraza are nevoie de ioni de magneziu pentru activitate, astfel încât magneziul este separat chimic de reacție prin legarea de un compus chimic și este eliberat în soluție numai la temperaturi ridicate
Legatura necovalentă a inhibitorului: în această metodă o peptidă, un anticorp sau un aptamer sunt legați necovalent de enzimă la temperaturi scăzute și inhibă activitatea acesteia. După o incubare de 1-5 minute la 95 °C, inhibitorul este eliberat și reacția începe.
Taq polimeraza Taq sensibilă la rece: este o ADN polimerază modificată cu activitate aproape nulă la temperaturi scăzute.
Modificare chimică: în această metodă, o moleculă mică este legată covalent de lanțul lateral al unui aminoacid din situsul activ al ADN polimerazei. Molecula mică este eliberată din enzimă prin incubarea amestecului de reacție timp de 10-15 minute la 95 °C. Odată ce molecula mică este eliberată, enzima este activată.
Modificări structurale ale primerilorEdit
O altă abordare pentru a preveni sau a reduce formarea PD este prin modificarea primerilor astfel încât aneantizarea cu ei înșiși sau între ei să nu provoace extensia.
HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System): la capătul 5′ al primerului se adaugă o coadă de nucleotide, complementară cu capătul 3′ al primerului. Datorită apropierii apropiate a cozii 5′, aceasta se aneantizează la capătul 3′ al amorselor. Rezultatul este un amorsă cu buclă de tulpină care exclude aneantizarea care implică suprapuneri mai scurte, dar permite aneantizarea amorsă la secvența sa complet complementară din țintă.
Amorsă chimeră: unele baze ADN din amorsă sunt înlocuite cu baze ARN, creând o secvență chimeră. Temperatura de topire a unei secvențe chimerice cu o altă secvență chimerică este mai mică decât cea a secvenței chimerice cu ADN. Această diferență permite setarea temperaturii de aneantizare astfel încât amorsa să se aneantizeze cu secvența sa țintă, dar nu și cu alte amorse chimerice.
Amorse blocabile: o metodă cunoscută sub numele de PCR dependentă de RNază H (rhPCR), utilizează o RNază HII termostabilă pentru a îndepărta o grupare de blocare din amperele PCR la temperaturi ridicate. Această enzimă RNază HII nu prezintă aproape nicio activitate la temperaturi scăzute, ceea ce face ca îndepărtarea blocării să aibă loc numai la temperaturi ridicate. Enzima posedă, de asemenea, o discriminare inerentă a nepotrivirii primer:șablon, ceea ce duce la o selecție suplimentară împotriva dimerilor de primer.
Prevenirea achiziției de semnal de la dimerii de primerEdit
În timp ce metodele de mai sus sunt concepute pentru a reduce formarea PD, o altă abordare are ca scop minimizarea semnalului generat de PD în PCR cantitativ. Această abordare este utilă atâta timp cât se formează puțini PD și efectul lor inhibitor asupra acumulării de produs este minor.
PCR în patru etape: se utilizează atunci când se lucrează cu coloranți nespecifici, cum ar fi SYBR Green I. Se bazează pe lungimea diferită și, prin urmare, pe temperatura de topire diferită a PD-urilor și a secvenței țintă. În această metodă, semnalul este obținut sub temperatura de topire a secvenței țintă, dar deasupra temperaturii de topire a PD-urilor.
Sondele specifice secvenței: Sondele TaqMan și balizele moleculare generează semnal numai în prezența secvenței lor țintă (complementară), iar această specificitate sporită exclude achiziția de semnal (dar nu și posibilele efecte inhibitorii asupra acumulării de produs) din partea PD-urilor.
.