Sensibilitatea antimicrobiană in vitro a Aerococcus urinae la 14 antibiotice, și curbe time-kill pentru penicilină, gentamicină și vancomicină

Abstract

Aerococcus urinae este un nou-venit în practica clinică și microbiologică, cauzând infecții ale tractului urinar, bacteriemie/septicemie și/sau endocardită. Acest studiu prezintă pentru prima dată o evaluare a activității unui panel reprezentativ de antibiotice împotriva unui număr mare de izolate de A. urinae. Sensibilitatea in vitro (CMI) a 56 de izolate de A. urinae la 14 antibiotice a fost determinată prin diluție în agar. În general, izolatele de A. urinae au prezentat o variabilitate mică între izolate și au avut CMI scăzute la penicilină, amoxicilină, piperacilină, cefepime, vancomicină și rifampicină. Rezistența la nivel înalt la aminoglicozide nu a fost găsită la niciunul dintre izolate. O activitate moderată spre bună a fost observată cu chinolonele, eritromicina și tetraciclina. Izolații de la doi pacienți cu endocardită au fost studiați cu ajutorul curbelor time-kill pentru penicilină, gentamicină și vancomicină. Penicilina și vancomicina singure au prezentat o activitate bactericidă lentă sau inexistentă împotriva celor două tulpini. Atunci când s-a combinat fie penicilina, fie vancomicina cu gentamicina, s-a obținut o activitate bactericidă rapidă pentru ambele tulpini cu ambele combinații. Opțiunile de tratament pentru A. urinae par să includă penicilinele pentru cazurile mai puțin severe. În cazurile severe, de exemplu endocardita, investigațiile time-kill sugerează un efect benefic al combinației cu gentamicina. La pacientul alergic la penicilină, vancomicina în combinație cu gentamicina reprezintă alternativa cea mai evidentă.

Introducere

În ultimul deceniu, relevanța clinică a diverșilor cocci Gram-pozitivi catalazei-negativi a primit multă atenție.1 Printre aceștia, Aerococcus urinae este un nou-venit în practica clinică și microbiologică, raportat pentru prima dată în 19892 și desemnat în 1992.3A. izolatele urinae au fost recunoscute inițial prin morfologia lor celulară (asemănătoare stafilococului în colorația Gram) și caracteristicile de creștere (asemănătoare streptococilor α-hemolitici pe agar sânge), o reacție negativă la catalază și o antibiogramă foarte constantă care demonstrează sensibilitate la penicilină și rezistență la sulfonamide și aminoglicozide.2-4 În două rapoarte, tulpini de A. urinae au fost izolate din 0,4-0,8% din probele de urină examinate.2,5 Majoritatea pacienților de la care a fost izolat A. urinae erau vârstnici cu condiții predispozante și semne de infecție a tractului urinar.2,4,5 Tulpinile care cauzează infecții ale tractului urinar au fost recunoscute în Danemarca, Suedia, Țările de Jos, Franța, SUA, Canada și țările din America de Sud.6A. urinae a fost, de asemenea, izolată din sângele pacienților care sufereau de bacteriemie/septicemie urogenă cu sau fără endocardită.7-11 Un studiu efectuat la nivel național în Danemarca în perioada 1987-1995 a identificat 26 de pacienți cu A. urinae izolată din sânge,6 ceea ce corespunde la 0,5 pacienți/an/1 milion de locuitori și la 0,8% din episoadele de endocardită infecțioasă.8 Episoadele bacteriemice/septicemice au răspuns bine la tratamentul cu β-lactame singure sau în combinație cu o aminoglico-side, cu excepția cazului în care bacteriemia s-a complicat cu endocardită, caz în care cinci din șase pacienți au decedat. La un pacient, la autopsie, A. urinae a putut fi cultivat din valve, în ciuda unui tratament antibiotic aparent relevant. Prin urmare, trebuie determinat tratamentul optim al endocarditei cu A. urinae.

Testarea izolatelor de A. urinae prin metode de difuzie pe tabletă/disc a evidențiat sensibilitatea la o gamă largă de agenți antimicrobieni, inclusiv la antibiotice β-lactamice și non-β-lactamice.5,6,12 Deoarece izolatele de A. urinae au fost asociate în principal cu infecții ale tractului urinar, este demn de remarcat faptul că tulpinile au fost găsite rezistente la sulfonamide și la alte antimicrobiene utilizate pentru tratarea infecțiilor tractului urinar, inclusiv co-trimoxazol, trimetoprim, acid nalidixic și polimixine.2,5,6,12 Recent, sensibilitatea a două izolate de A. urinae de la pacienți cu endocardită a fost investigată prin intermediul CMI-urilor a șapte antibiotice și au fost realizate curbe time-kill pentru penicilină în combinație cu gentamicină sau netilmicină.11. Studiul de față caracterizează în continuare modelul de sensibilitate a 56 de izolate de A. urinae de diferite origini geografice. S-au determinat CMI-urile a 14 antibiotice și pentru două izolate s-au efectuat experimente de curbe time-kill cu penicilină, gentamicină și vancomicină, singure sau în combinație, pentru a obține mai multe informații despre regimurile optime de tratament al infecțiilor grave cauzate de A. urinae.

Materiale și metode

Straine

Cincizeci și șase de izolate clinice de A. urinae, fără legătură epidemiologică, fără legătură între ele. urinae au fost studiate, cuprinzând 42 de izolate daneze (17 izolate de sânge și 25 izolate de urină) și 14 izolate de urină non-daneze: unul din Țările de Jos (furnizat cu amabilitate de P. J. G. M. Rietra), patru din Suedia (furnizat cu amabilitate de E. Falsen, Culture Collection, University of Göteborg) și șapte izolate nord-americane (furnizat cu amabilitate de R. R. Facklam, The Streptococcus Laboratory, CDC, Atlanta, GA, SUA). Au fost utilizate următoarele tulpini de referință: Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATTC 25922 și Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Agenți antimicrobieni

Au fost utilizați următorii agenți antimicrobieni: benzilpenicilină (Leo, Ballerup, Danemarca); cefepime (Bristol-Myers Squibb, Wallingford, CT, SUA); amoxicilină, ceftriaxonă, eritromicină, amikacină, gentamicină, netilmicină, rifampicină, vancomicină (Sigma, St Louis, MO, SUA); oxitetraciclină (Rosco, Taastrup, Danemarca), piperacilină (Lederle, Pearl River, NY, SUA), ciprofloxacină (Bayer, Leverkusen, Germania); și sparfloxacină (Rhône Poulenc Rorer, Vitry, Franța).

Determinarea CMI

Datorită creșterii fastidioase a A. urinae, condițiile de testare au trebuit să fie modificate față de recomandările standard pentru a efectua determinările CMI (adică suplimentarea agarului cu 5% sânge și incubarea în atmosferă cu 5% CO2 timp de 48 h).13-15 CMI au fost determinate prin metoda diluției în agar. S-au preparat diluții în serie de două ori a agenților antimicrobieni în agar Mueller-Hinton (Difco Laboratories GmbH, Augsburg, Germania) suplimentat cu 5% sânge de cal lizat. Antibioticele au fost testate de la 0,008 la 512 mg/L, cu excepția amoxicilinei (0,032-256 mg/L), a rifampicinei (0,008-32 mg/L) și a oxitetraciclinei (0,008-2 mg/L). Inoculele de 107 ufc/mL (104 ufc/punct) au fost preparate din culturi de agar de o noapte și suspendate în NaCl 0,9 % și au fost aplicate cu un inoculator multiplu cu 21 de puncte (Denley Instruments Ltd, Billinghurst, Regatul Unit). Rezultatele au fost citite după incubare timp de 2 zile la 37°C la 5% CO2. CMI a fost citită ca fiind cea mai mică concentrație care prezintă creșterea a maximum trei colonii.

Investigații privind curba time-kill

Au fost investigate două dintre izolatele sanguine testate (B1 și B8), ambele de la pacienți cu endocardită. Tulpinile au fost testate împotriva penicilinei (MIC 0,125 și, respectiv, 0,6 mg/L), gentamicinei (MIC 256 și, respectiv, 64 mg/L) și vancomicinei (MIC 0.5 și, respectiv, 1 mg/L) în următoarele concentrații care pot fi obținute clinic: penicilină 2 × și 10 × MIC (P2 și, respectiv, P10); vancomicină 4 × și 10 × MIC (V4 și, respectiv, V10); gentamicină 10 mg/L (G10); și combinațiile penicilină + gentamicină și vancomicină + gentamicină în următoarele concentrații: P2G10, P10G10, V4G10 și, respectiv, V10G10. La t = -1 h, coloniile proaspete crescute peste noapte au fost suspendate la aproximativ 105 ufc/mL în tuburi cu bulion Todd-Hewitt preîncălzit. Tuburile au fost plasate într-o baie de apă la 37 °C. La t = 0 h, antibioticele, pregătite imediat înainte de testare, au fost adăugate în tuburi în două exemplare. Trei tuburi fără antibiotice au fost utilizate ca martor de creștere. Din fiecare tub s-au prelevat probe în dublu exemplar la 0, 3, 6 și 24 de ore. Eș antioanele au fost diluate în serie ș i plantate. Numărul de colonii supraviețuitoare a fost numărat după o noapte de incubare la 37°C în aer ambiant în saci de plastic împreună cu hârtie de țesut umedă. Folosind probe de 20 μL, numărul minim de bacterii numărabile a fost de 50 ufc/mL. Efectul de transfer a fost eliminat pentru experimentele cu penicilină-gentamicină prin adăugarea a 100 μL 100 000 U/mL de penicilinază pe fiecare placă. Pentru experimentele cu vancomicină-gentamicină, efectul de transfer a fost eliminat prin diluție. O investigație pilot a demonstrat efectul de transfer în proba de 100, dar nu și în proba de 10-1. Prin urmare, ufc au fost numărate folosind 200 μl din probele de 10-1, ceea ce dă o limită de detecție de 50 ufc/mL. Toate experimentele au fost efectuate de cel puțin două ori în zile diferite. Activitatea bactericidă a fost definită ca o reducere a inoculului cu cel puțin 99,9 % în decurs de 24 de ore. Sinergia (S), efectul aditiv (A) și antagonismul au fost definite astfel: >2 log mai mult de ucidere (S), >1 și <2 log mai mult de ucidere (A) și, respectiv, >2 log mai puțin de ucidere, pentru combinație în comparație cu cel mai bun dintre antibioticele individuale.

Rezultate

Determinare MIC

CMI-urile obținute pentru cele 56 de izolate sunt prezentate în tabel. Utilizând punctele de rupere pentru streptococi recomandate de NCCLS14,15 sau de Grupul suedez de referință pentru antibiotice (SRGA),16,17, izolatele au fost sensibile la peniciline, în timp ce pentru cefalosporinele testate s-a constatat o sensibilitate redusă. CMI-urile pentru aminoglicozide au indicat o sensibilitate redusă pentru aproape toate izolatele. Cu toate acestea, rezistența de nivel înalt la aminoglicozide (adică gentamicină > 1000 mg/L) nu a fost găsită pentru niciunul dintre izolate. Toate izolatele au fost sensibile la vancomicină. Rifampicina a fost cel mai activ medicament testat, cu o CMI50 de 0,031 mg/L (interval <0,004-0,064 mg/L), cu excepția unui izolat cu o CMI > 32 mg/L (teste repetate). Activitățile chinolonilor ciprofloxacină și sparfloxacină s-au dovedit a fi la fel de bune.

Examinări ale curbelor de ucidere

Curbele medii de ucidere în timp pentru fiecare experiment sunt prezentate în figură. Vancomicina singură (atât 4 × cât și 10 × CMI) a prezentat o activitate bactericidă împotriva tulpinii B1. În cazul penicilinei, activitatea bactericidă a fost constatată doar pentru 10 × MIC împotriva tulpinii B8. Pentru ambele antibiotice, efectul bactericid a fost lent, adică a apărut pentru prima dată după 24 h. Gentamicina nu a avut efect bactericid – în majoritatea experimentelor s-a observat o creștere. Penicilina în combinație cu gentamicina a fost sinergică și a avut un efect bactericid rapid asupra tulpinii B8 atât în P2G10, cât și în P10G10. Cu toate acestea, pentru tulpina B1, s-a constatat doar un efect bactericid aditiv și lent. În cazul combinării vancomicinei cu gentamicina, s-a constatat un efect bactericid rapid pentru ambele tulpini. Un efect sinergic a fost detectabil după 3 h și 6 h pentru tulpina B8. Cu toate acestea, la 24 de ore, activitatea ucigașă a vancomicinei a fost atât de pronunțată încât nu a fost posibil să se detecteze un efect sinergic. Pentru B1 s-a constatat doar un efect aditiv. Nu au fost înregistrate efecte antagoniste în niciunul dintre experimente.

Discuție

Acest studiu prezintă pentru prima dată o evaluare a CMI-urilor unui panel reprezentativ de antibiotice împotriva unui număr mare de izolate de A. urinae obținute de la pacienți cu infecție a tractului urinar, bacteriemie/septicemie și/sau endocardită. Pentru a evalua utilizarea antibiogramelor în scopuri taxonomice, au fost examinate anterior CMI-urile a 15 antibiotice pentru 10 tulpini de A. urinae,12 dar nu au fost prezentate date detaliate.

A. urinae sunt organisme fastidioase care necesită suplimentarea cu sânge a mediilor și, uneori, incubarea într-o atmosferă îmbogățită cu CO2 și/sau o perioadă de incubare prelungită pentru a obține o creștere suficientă pentru testarea sensibilității la antibiotice. Prin urmare, tulpinile nu au putut fi testate folosind condițiile standard descrise de BSAC sau NCCLS.13-15 Necesitatea de a modifica condițiile de cultură este, totuși, o problemă obișnuită pentru bacteriile Grampozitive fastidioase.18,19A. urinae izolate au prezentat un model de sensibilitate antimicrobiană similar cu cel al streptococilor α-haemo-litici, cu doar mici variații de sensibilitate între izolate. CMI ale β-lactaminelor pentru izolate au fost, de obicei, în cadrul a patru etape de diluție de două ori, cu excepția cefalosporinelor ceftriaxonă și cefepime, care au prezentat o variație mai mare a CMI (tabel). Din cauza posibilei influențe a incubării cu CO2 (scăderea pH-ului), trebuie să se dea dovadă de prudență atunci când se apreciază sensibilitatea la tetraciclină (sensibilitate supraestimată) și eritromicină (sensibilitate subestimată). Printre izolatele de A. urinae examinate, nu a fost identificată nici o rezistență de nivel înalt la aminoglicozidele testate, ceea ce lasă deschisă posibilitatea unui efect sinergic atunci când sunt combinate cu o β-lactamă sau cu vancomicina (vide infra). După cum reiese din valorile CMI, există mai multe alternative de tratament pentru infecțiile grave, deoarece izolatele au fost sensibile la peniciline, vancomicină și rifampicină (cu excepția unui izolat). Chinolonele selectate, ciprofloxacina și sparfloxacina, au prezentat, de asemenea, o activitate bună. Deși este un organism fastidios, rezultatele obținute prin metodele de difuzie pe disc2,5,20 au fost în concordanță cu CMI-urile prezentate în acest studiu, sugerând că se poate obține un rezultat fiabil folosind aceste metode de sensibilitate de rutină.

Legitimările pentru tratamentul infecțiilor grave, cum ar fi septicemia cu sau fără endocardită, ar trebui să se bazeze în mod optim pe experiența clinică în cadrul unor studii atent concepute, dar acest lucru este dificil atunci când avem de-a face cu bacterii rare. Prin urmare, studiile in vitro care includ tehnici de curbă de ucidere pot furniza informații importante pentru clinician în aceste cazuri.

Pentru experimente au fost alese concentrații antibiotice realizabile in vivo. Pentru gentamicină a fost aleasă o doză de 10 mg/L, care corespunde concentrației obținute printr-o doză zilnică unică de 240 mg (echivalentă cu 3-4 mg/kg).21 În plus, deși mai multe lucrări susțin o dozare de două ori pe zi pentru endocardită, în Danemarca se utilizează în mod obișnuit gentamicina o dată pe zi, datorită reducerii nefrotoxicității și a faptului că efectul sinergic cu antibioticele β-lactamice crește odată cu creșterea concentrațiilor de aminoglicozide.22 Datele obținute în studiul nostru in vitro al curbelor de ucidere pentru penicilină și vancomicină au arătat că nici penicilina, nici vancomicina nu au fost bactericide împotriva oricăruia dintre cele două izolate testate de la pacienții cu endocardită infecțioasă. Atunci când a fost combinat cu gentamicină, s-a obținut un efect bactericid împotriva ambelor izolate atât pentru penicilină, cât și pentru vancomicină. Din fericire, aceste regimuri sunt recomandate pentru tratarea endocarditei infecțioase de etiologie necunoscută în întreaga lume.23 Ratele de ucidere ale celor două tulpini au fost diferite, ceea ce indică faptul că pot exista variații între tulpini. În ciuda susceptibilității in vitro la antibioticele administrate, am constatat că prognosticul este slab pentru pacienții vârstnici care suferă de endocardită infecțioasă cauzată de A. urinae.8 Rezultatele prezente pentru penicilină, gentamicină și netilmicină (CMI) sunt în concordanță cu cele din recentul raport elvețian al lui Zbinden et al.11 pentru două izolate de A. urinae de la pacienți cu endocardită.

Opțiunile de tratament pentru A. urinae par să includă peniciline pentru cazurile mai puțin severe. În cazurile severe, adică endocardita, investigațiile time-kill sugerează un beneficiu al combinării penicilinei sau vancomicinei cu gentamicina. La pacientul alergic la penicilină, vancomicina reprezintă alternativa cea mai evidentă.

.