Sfaturi și trucuri pentru mutageneza dirijată pe situs

Mutageneza dirijată pe situs (SDM) este o tehnică utilizată pentru a muta una sau mai multe baze dintr-o plasmidă. Această abordare poate schimba compoziția aminoacizilor, poate distruge situsurile de legare a factorilor de transcripție sau poate crea proteine de fuziune – pentru a numi doar câteva exemple.

Deși SDM este folosită cel mai mult pentru a sonda structura și activitatea biologică a acizilor nucleici și a proteinelor, este, de asemenea, utilă pentru a introduce sau a elimina situsurile de recunoaștere a enzimelor de restricție pentru a facilita clonarea.

În plus, SDM poate fi un instrument util de optimizare a codonilor pentru a înlocui codonii rari în vectorii de expresie pentru a îmbunătăți eficiența exprimării proteinei heterologe. Acest lucru este uneori necesar din cauza prejudecății codonilor, un fenomen prin care organismele au o preferință pentru anumiți codoni în detrimentul altora, în funcție de disponibilitatea ARNt în celulă. Puteți citi mai multe despre utilizarea codonilor și despre prejudecata codonilor aici.

Când este utilizată pentru a modifica secvența de codificare, SDM creează construcții mutante specifice care nu au reziduuri critice sau domenii proteice implicate în modificările post-translaționale sau în reglarea stabilității proteinei. Eliminarea reziduurilor sau regiunilor critice din plasmidele dumneavoastră, cum ar fi situsurile de fosforilare sau domeniile critice, oferă o modalitate de a demonstra importanța anumitor caracteristici ale proteinei. De exemplu, modificarea situsurilor de fosforilare, cum ar fi serina în alanină nereactivă sau în fosfomimetice, cum ar fi acidul aspartic, aduce dovezi fiabile pentru fosforilarea proteică specifică locului. Aceasta permite studierea implicațiilor in vitro ale unor astfel de modificări post-translaționale.

Abordări tradiționale ale mutagenezei dirijate pe situs

PCR inversă

Pentru deleții sau inserții de >50 bp, PCR inversă este cea mai populară abordare. PCR inversă utilizează primeri spate în spate pentru a amplifica întreaga plasmidă, urmată de ligatura produsului liniar care formează ADN circular. Această tehnică este, de asemenea, potrivită pentru inserții sau deleții mai mari, de exemplu, eliminarea unui domeniu de reglare dintr-o proteină.

Pentru deleții, zona selectată poate fi eliminată prin proiectarea unor primeri care se annează de o parte și de alta a zonei de deleție vizate. Amplificarea se desfășoară spre exterior din această zonă, excluzând astfel această regiune din produsul PCR. Odată ce produsul liniar este ligaturat, noua dumneavoastră construcție va fi lipsită de acest domeniu de deleție. Acest proces este descris schematic în figura 1 de mai jos.

Figura 1. Protocol pentru PCR inversă în SDM.

Inserțiile pot fi realizate prin utilizarea de primeri suprapuși cu secvențe flancate care conțin bazele suplimentare corespunzătoare. Pentru mai multe informații despre PCR inversă, verificați aceste resurse:

• Ochman et al. (1998) Genetic Applications of an Inverse Polymerase Chain Reaction. Genetică. 120:621-623.
• Clifford N. Dominy și David W. Andrews. Site-Directed Mutagenesis by Inverse PCR.

SDM Using Modified Primers

Această tehnică folosește primeri modificați pentru a încorpora mici modificări ale perechilor de baze într-o plasmidă și este metoda de elecție pentru mutații site-specifice. Pentru început, va trebui să proiectați niște primeri. Dar înainte de a începe:

• Imprimați o copie a unui tabel de codoni de aminoacizi
• Aveți la îndemână secvența de plasmidă sau de proteină.
• Asigurați-vă că știți unde se află codonul de început și în ce cadru de citire se citește secvența dvs.

Proiectarea amorselor

Tintiți să obțineți amorsă SDM cu o lungime de aproximativ 30 pb, cu situsul dvs. mutant cât mai aproape de centru. Deși este acceptabil să faceți amorsele puțin mai lungi sau mai scurte, după cum este necesar, ar trebui să existe un minim de 12 pb de o parte și de alta a situsului dvs. mutant.

Dacă aveți nevoie de ajutor cu proiectarea amorselor, http://molbiol-tools.ca/PCR.htm enumeră câteva resurse foarte utile pentru a vă pune pe cale.

Scoateți reactivii potriviți

Taq polimeraza ordinară pur și simplu nu va fi suficientă când vine vorba de SDM – trebuie să folosiți o enzimă de corecție. Există o varietate de kituri de polimeraze disponibile în comerț care sunt potrivite pentru această sarcină, încorporând o serie de caracteristici, inclusiv fidelitate ridicată (capacitate de proofreading) și activare cu pornire la cald. O posibilitate este In-Fusion HD Cloning Plus de la Takara – o soluție „all in 1” care include o polimerază de înaltă fidelitate, un kit de purificare PCR, o enzimă de clonare și celule competente pentru mutageneză dirijată de situs.

Rețineți că, la fel ca majoritatea reactivilor de laborator, multe polimeraze vin cu avantajele și dezavantajele lor – în general, laboratoarele vor avea motive istorice pentru a alege una în detrimentul celeilalte și rareori se abat de la acestea. În timp ce rămânerea la ceea ce funcționează este sensibilă, nu este rău să citiți literatura de specialitate pe alte resurse disponibile pentru a vă asigura că aveți cei mai buni reactivi pentru treabă!

Reacția PCR

Condițiile PCR utilizate vor varia în funcție de alegerea kitului și a polimerazei, precum și de amorsele pe care le-ați proiectat și de mărimea produsului. Cu toate acestea, exemplul prezentat mai jos este un bun punct de plecare.

.

Step	Temp (°C)	Timp (s)	Cicluri
Denatura	94	15	18
Anneal	60	30	18
Extensie	72	20/kb plasmidă	18

Tabel 1: Exemplu de program de cicluri termice SDM

Menținerea unui număr redus de cicluri va împiedica apariția unor mutații nedorite. Optsprezece cicluri ar trebui să dea o cantitate rezonabilă de produs mutat fără a încorpora mutații nedorite. Rețineți că numărul de cicluri poate fi modificat în timpul depanării, dacă este necesar.

Digestiați-l!

Acum că aveți produsul PCR gata, nu uitați de etapa critică – digestia! Aici, digerați ADN-ul șablon parental pentru a vă asigura că aveți doar plasmidul mutant pentru transformarea bacteriană. Protocoalele standard prevăd o incubare de 1 oră la 37°C cu endonucleaza Dpn1 pentru a digera tot ADN parental dam-metilat și hemi-metilat, lăsându-vă cu plasmidul mutat dorit.

Transformare și secvențiere

Transformați plasmidul dumneavoastră în celule competente la fel ca în cazul oricărei alte plasmide de expresie și izolați colonii unice pentru izolarea plasmidelor.

Acum ar trebui să aveți un volum mic de plasmidă dorită. Înainte de a începe să experimentați, trimiteți o probă pentru secvențiere pentru a confirma prezența modificării (modificărilor) dorite. Este la fel de important să vă asigurați de absența oricăror mutații secundare nedorite.

Dacă secvențierea revine cu un rezultat pozitiv – felicitări, sunteți un profesionist în SDM! Dar dacă secvențierea revine cu un rezultat negativ – nu vă îngrijorați! Puteți oricând să încercați din nou – sfaturile noastre de expert pentru depanarea SDM ar trebui să vă readucă pe drumul cel bun!

În zilele noastre, scăderea costurilor de sinteză a oligonucleotidelor și progresele în biologia sintetică înseamnă că abordările sintetice câștigă tracțiune față de mutageneza dirijată pe site. În plus, apariția tehnologiei CRISPR/Cas9 a simplificat, de asemenea, editarea genelor, astfel încât mutageneza poate fi realizată acum in vitro și in vivo în câțiva pași simpli. Cu toate acestea, SDM continuă să fie un pilon de bază în setul de instrumente de biologie moleculară și nu va pleca nicăieri prea curând.

Publicat inițial în 2016. Actualizat și republicat în 2018.