Testul Ames este un test biologic pentru evaluarea potențialului mutagen al compușilor chimici. Acesta utilizează bacterii pentru a testa dacă o anumită substanță chimică poate provoca mutații în ADN-ul organismului testat. Testul a fost dezvoltat de Bruce N. Ames în anii 1970 pentru a determina dacă o substanță chimică aflată la îndemână este mutagena.
Obiectiv
Determinarea activității mutagene a substanțelor chimice prin observarea dacă acestea provoacă mutații în bacteriile din eșantion.
Principiu
- Testul Ames utilizează mai multe tulpini de bacterii (Salmonella, E.coli) care poartă o anumită mutație.
- Mutațiile punctiforme se fac în operonul histidinei (Salmonella typhimurium) sau al triptofanului (Escherichia coli), ceea ce face ca bacteriile să fie incapabile să producă aminoacidul corespunzător.
- Aceste mutații au ca rezultat organisme his- sau trp- care nu se pot dezvolta decât dacă li se furnizează histidină sau triptofan.
- Dar cultivarea Salmonella His- este într-un mediu care conține anumite substanțe chimice, provoacă mutații în gena care codifică histidina, astfel încât își recapătă capacitatea de a sintetiza histidina (His+). Aceasta înseamnă că, atunci când are loc un eveniment mutagen, substituțiile de baze sau deplasările de cadre în cadrul genei pot provoca o revenire la prototrofia aminoacizilor. Aceasta este mutația inversă.
- Aceste bacterii inversate vor crește apoi în medii cu deficit de histidină, respectiv triptofan.
Potențialul mutagen al unei probe se evaluează prin expunerea organismelor care necesită aminoacizi la diferite concentrații de substanțe chimice și prin selectarea evenimentului de inversiune. Pentru această selecție se utilizează medii lipsite de aminoacidul specific, care permit supraviețuirea și creșterea doar a acelor celule care au suferit reversia la prototrofia histidină / triptofan. În cazul în care proba de testare provoacă această reversie, aceasta este un agent mutagen.
Metodă
I ) Se izolează o tulpină auxotrofă de Salmonella Typhimurium pentru histidină. (adică His-ve)
II) Se prepară o suspensie de testare de Salmonella Typhimurium his-ve într-un tampon simplu cu substanța chimică de testare (de exemplu, 2-aminofluoren). De asemenea, adăugați o cantitate mică de histidină.
Nota: este necesară o cantitate mică de histidină pentru ca bacteriile să înceapă să crească. Odată ce histidina este epuizată, numai acele bacterii care au suferit mutații pentru a dobândi capacitatea de a sintetiza histidina formează colonii.
III) Pregătiți, de asemenea, o suspensie martor de Salmonella Typhimurium His-ve, dar fără substanțe chimice de testare.
IV) Incubați suspensiile la 37°C timp de 20 de minute
V) Pregătiți cele două plăci de agar și împrăștiați suspensia pe placa de agar.
VI) Incubați plăcile la 37°C timp de 48 de ore.
VII) După 48 de ore, numărați numărul de colonii din fiecare placă.
Interpretarea rezultatelor
- Mutagenitatea substanțelor chimice este proporțională cu numărul de colonii observate.
- Dacă există un număr mare de colonii pe placa de test în comparație cu cea de control, atunci se spune că aceste substanțe chimice sunt mutagene.
- Un număr foarte mic de colonii poate fi observat și pe placa de control. Acest lucru se poate datora unei mutații punctiforme spontane pe gena care codifică hisidina.
Utilizări
În timp ce testul Ames este folosit pentru a identifica mutațiile inverse care sunt prezente în tulpini, acesta poate fi folosit și pentru a detecta mutagenitatea probelor de mediu, cum ar fi medicamentele, coloranții, reactivii, produsele cosmetice, apele reziduale, pesticidele și alte substanțe care sunt ușor de solubilizat într-o suspensie lichidă.
Merite
- Dezvoltare bacteriană simplă, rapidă și robustă.
- Facilitatea și costul redus al testului îl fac neprețuit pentru depistarea substanțelor din mediul nostru pentru posibila carcinogenitate.
- Testul Ames poate detecta mutanți adecvați în populații mari de bacterii cu o sensibilitate ridicată.
Limitări
- Câteva substanțe care provoacă cancer la animalele de laborator (de exemplu, dioxina) nu dau un test Ames pozitiv (și invers)
- Testul Ames constă în tulpini de Salmonella typhimurium și, prin urmare, nu este un model perfect pentru om.
.