Testul de migrație Transwell este o tehnică clasică care permite oamenilor de știință să cuantifice mișcarea celulelor. Migrația se referă la capacitatea unei celule de a se deplasa individual sau în grupuri. Mișcările celulelor sunt posibile prin restructurarea precisă a citoscheletului lor, iar migrația are loc, de obicei, ca răspuns la stimuli care acționează ca indicii.
Astăzi, vom discuta despre testul de migrație transwell, care utilizează o configurație simplă a camerei pentru a evalua migrația ca răspuns la indicii de atragere.
Vom începe prin a oferi câteva informații de fond despre camera transwell.
Aparatul a fost proiectat pentru prima dată de Dr. Stephen Boyden în 1961, care l-a folosit pentru a studia migrația leucocitelor. Prin urmare, această metodă este cunoscută și sub numele de testul cu camera Boyden.
Într-o cameră Boyden simplă, peretele exterior este format din godeuri, ca cele ale unei plăci cu 96 de godeuri. În interiorul fiecărei godeuri, se plasează un transwell, care este o inserție cilindrică. Inserția are o membrană din policarbonat cu o dimensiune definită a porilor. Atunci când este plasat în puț, acesta împarte camera în două compartimente. Compartimentul superior este cel în care vor fi însămânțate celulele al căror comportament migrator urmează să fie studiat, iar rezervorul inferior este cel în care se plasează soluția de chemoattractant. Prin definiție, un chemoattractant este o moleculă care are capacitatea de a favoriza motilitatea celulară prin „atragerea celulelor.”
Datorită acestor forțe de atracție, celulele din compartimentul superior migrează prin pori în rezervorul de jos. Dacă celulele au proprietăți aderente, precum unele celule de melanom, în urma mișcării se vor „lipi” de partea inferioară a membranei. În acest caz, membrana poate fi fixată, colorată, iar celulele pot fi numărate la microscop. Pe de altă parte, celulele neaderente, precum spermatozoizii, vor migra în rezervorul de jos. În acest caz, celulele din soluția rezervorului pot fi numărate cu ajutorul unui hemocitometru.
Deși configurația pentru acest test este simplă, există câteva lucruri pe care trebuie să le luați în considerare înainte de experiment. Să trecem în revistă câteva dintre ele.
Începând cu soluția de însămânțare, trebuie să vă asigurați că densitatea este optimizată pentru a observa migrația celulară. Prea puține celule pot duce la o migrație nedetectabilă, iar densitățile mai mari vor suprapopula membrana, făcând dificilă enumerarea migrației. Al doilea aspect de luat în considerare este dimensiunea porilor inserției. Aceasta trebuie aleasă cu atenție în funcție de tipul de celule. Dacă dimensiunea porilor este prea mică, celulele nu vor putea trece prin ea.
Alternativ, dacă dimensiunea porilor este prea mare, celulele vor cădea pur și simplu prin ea, ceea ce nu reprezintă migrație. În cele din urmă, trebuie să se țină cont de concentrația de chemoattractant și de timpul de incubare care trebuie acordat pentru migrație, deoarece acestea sunt interdependente. O concentrație optimă și un timp de incubare adecvat, în timpul căruia se menține un gradient de concentrație între compartimente, induc migrația celulară datorită chemo-atracției. Dimpotrivă, incubările prelungite pot fi însoțite de o echilibrare a chimioattractantului în toată camera, ceea ce duce la pierderea gradientului chimic, ceea ce poate încurca analiza rezultatelor obținute.
Cu aceste considerente în minte, să discutăm un protocol utilizat pentru a măsura migrația celulelor aderente.
Celele care urmează să fie testate sunt pregătite într-un mediu fără proteaze, deoarece proteazele pot denatura receptorii membranari importanți și, în cele din urmă, pot afecta migrația. După ce celulele sunt pregătite, suspensia trebuie diluată până la o densitate optimă de însămânțare. Pentru a pregăti camera, transwells sunt plasate în godeuri pe o placă cu mai multe godeuri. Suspensia celulară trebuie pipetată în transwell fără a atinge membrana sau a introduce bule de aer.
Soluția de chemoattractant se pipetează în rezervorul inferior, asigurându-se că soluția atinge membrana inserției. Timpul de incubare pentru migrare va depinde de considerentele experimentale. După incubare, membranele se fixează prin scufundarea inserției în etanol 70%. După ce se lasă insertul să se usuce, se adaugă soluția de colorare a celulelor.
În continuare, celulele sunt incubate timp de aproximativ 30 de minute la temperatura camerei. După incubare, inserțiile se spală cu ajutorul tamponului de spălare. În cele din urmă, membrana poate fi excizată și plasată pe o lamelă de microscop. Celulele de pe partea inferioară a membranei reprezintă numărul de celule care au migrat în prezența și în absența chemoattractanților.
Din moment ce, acum aveți o idee despre protocol, să aruncăm o scurtă privire asupra modului în care cercetătorii folosesc această metodă în explorările lor.
Una dintre cele mai comune aplicații ale acestui test este evaluarea proprietăților chemoattractante ale unor compuși necunoscuți. În acest caz, oamenii de știință au fost interesați să examineze traseele de înot ale spermatozoizilor de broască în prezența alurinei, care este o substanță secretată de ouăle de amfibieni. Pentru a face acest lucru, aceștia au pipetat mai întâi spermatozoizii de broască activi în partea superioară a inserțiilor transwell. În partea de jos, au adăugat alurină. După ce au lăsat celulele să migreze, au numărat spermatozoizii din soluția rezervorului la microscop. Folosind această tehnică, ei au reușit să genereze o curbă concentrație-răspuns care descrie efectul concentrației de alurină asupra migrației spermatozoizilor.
Când o celulă este atacată de agenți patogeni, aceasta trimite chemoattractanți pentru a recruta celule imune care migrează, se atașează și, ulterior, rezolvă infecția. Pentru a testa acest fenomen, acești cercetători au cultivat celule epiteliale pe partea inferioară a inserțiilor. Ulterior, ei au infectat aceste celule cu diferite tulpini de bacterii. În cele din urmă, au introdus celule imune în camera superioară. Se știe că celulele infectate produc mai mulți chemoattractanți care induc migrarea celulelor imune. Rezultatele acestui experiment au demonstrat grade diferite de migrare a neutrofilelor ca răspuns la diferite tipuri de infecție bacteriană.
În sfârșit, invazia și metastazarea celulelor canceroase prin matricea extracelulară i-a intrigat întotdeauna pe biologii celulari. Aici, oamenii de știință au dorit să determine modul în care chemoattractanții specifici pot contribui la o astfel de migrare printr-o matrice 3D. Aceștia au creat prin inginerie genetică două grupuri separate de celule: unul care exprimă o proteină fluorescentă verde, iar celălalt o proteină fluorescentă roșie. Apoi au pipetat o matrice extracelulară-mimică în partea superioară a transwell-urilor.
După ce s-a solidificat, au inversat transwell-ul și au însămânțat două grupuri de celule pe partea inferioară a membranei. Apoi, au înlocuit inserția în placa multiwell și au pipetat soluția chemoattractantă în camera superioară. Acest lucru a făcut ca celulele din partea de jos să se deplaseze în sus și prin matricea 3D. Cu ajutorul imagisticii confocale, acești cercetători au reconstruit migrația celulară în 3D și au distins modelele de migrare a două grupuri de celule.
Ai urmărit videoclipul lui JoVE despre testul de migrare transwell. Înțelegând componentele și protocolul acestei metode, știți acum de ce este atât de mult utilizată de biologii celulare. În ciuda simplității acestui montaj, gama de configurații pe care această metodă o poate adapta o face indispensabilă pentru studiile de motilitate celulară. Ca întotdeauna, vă mulțumim pentru vizionare!