Ames test är ett biologiskt test för att bedöma den mutagena potentialen hos kemiska föreningar. Det använder bakterier för att testa om en viss kemikalie kan orsaka mutationer i testorganismens DNA. Testet utvecklades av Bruce N. Ames på 1970-talet för att avgöra om en kemikalie är mutagen.
Mål
För att fastställa kemikaliers mutagena aktivitet genom att observera om de orsakar mutationer i provbakterier.
Princip
- Ames-testet använder sig av flera bakteriestammar (Salmonella, E.coli) som bär på en viss mutation.
- Punktmutationer görs i histidinoperonet (Salmonella typhimurium) eller tryptofanoperonet (Escherichia coli), vilket gör bakterierna oförmögna att producera motsvarande aminosyra.
- Dessa mutationer resulterar i his- eller trp- organismer som inte kan växa om inte histidin eller tryptofan tillförs.
- Men odling av His- Salmonella är i ett medium som innehåller vissa kemikalier, orsakar mutationer i histidin-kodande genen, så att de återfår förmågan att syntetisera histidin (His+). Detta innebär att när en mutagen händelse inträffar kan basersubstitutioner eller ramändringar i genen orsaka en återgång till aminosyraprototrofi. Detta är den omvända mutationen.
- Dessa omvända bakterier kommer sedan att växa i histidin- respektive tryptofanfattiga medier.
Ett provs mutagena potential bedöms genom att organismer som kräver aminosyror utsätts för olika koncentrationer av kemiska ämnen och genom att välja efter omvända händelser. Medier som saknar den specifika aminosyran används för detta urval, vilket gör att endast de celler som har genomgått omställningen till histidin/tryptofan-prototrofi kan överleva och växa. Om testprovet orsakar denna reversion är det en mutagen.
Metod
I ) Isolera en auxotrof stam av Salmonella Typhimurium för histidin. (dvs. His-ve)
II) Bered en testsuspension av His-ve Salmonella Typhimurium i en vanlig buffert med testkemikalie (t.ex. 2-aminofluoren). Tillsätt också en liten mängd histidin.
Anmärkning: En liten mängd histidin krävs för att bakterierna ska börja växa. När histidinet är uttömt bildar endast de bakterier som muterats för att få förmåga att syntetisera histidin kolonier.
III) Bered också en kontrollsuspension av His-ve Salmonella Typhimurium men utan testkemikalier.
IV) Inkubera suspensionerna vid 37 °C i 20 minuter
V) Förbered två agarplattor och sprid ut suspensionen på agarplattan.
VI) Inkubera plattorna vid 37 °C i 48 timmar.
VII) Efter 48 timmar räkna antalet kolonier i varje platta.
Resultattolkning
- Kemikaliernas mutagenicitet är proportionell mot antalet observerade kolonier.
- Om det finns ett stort antal kolonier på testplattan i jämförelse med kontrollplattan, sägs sådana kemikalier vara mutagena.
- Varje få antal kolonier kan ses även på kontrollplattan. Detta kan bero på en spontan punktmutation på den hisidin-kodande genen.
Användningsområden
Men Ames-testet används för att identifiera revertmutationer som finns i stammar, men det kan också användas för att påvisa mutagenitet hos miljöprover, t.ex. droger, färgämnen, reagenser, kosmetika, avloppsvatten, bekämpningsmedel och andra ämnen som lätt kan lösas upp i en flytande suspension.
Meriter
- Enkla, snabba och robusta bakterieanalyser.
- Testets enkelhet och låga kostnad gör det ovärderligt för screening av ämnen i vår miljö med avseende på eventuell karcinogenicitet.
- Ames-testet kan upptäcka lämpliga mutanter i stora bakteriepopulationer med hög känslighet.
Begränsningar
- Vissa ämnen som orsakar cancer hos försöksdjur (t.ex. dioxin) ger inte ett positivt Ames-test (och vice versa)
- Ames-testet består av Salmonella typhimurium-stammar och är därför inte en perfekt modell för människan.