GyrB och GyrA expression and purification
Sekvensen som kodar för den fullständiga E. coli GyrA (2-875) sattes in i en modifierad pET28b som innehöll en N-terminal 10-His tagg och en C-terminal Twin-strep tagg. Övexpression utfördes i E. coli BL21 (DE3) pRARE2 i LB-medium innehållande 50 µg/mL kanamycin och 35 µg/mL kloramfenikol. Cellerna inducerades med 0,35 mM IPTG efter att ha nått en OD600 0,85 och proteinet uttrycktes vid 37 °C i 4 timmar. Cellerna skördades och resuspenderades i lysisbuffert (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, 10 % v/v glycerol, pH 8,0) och lyserades med tre cykler av högtrycksdispersion med hjälp av EmulsiFlex-C3 vid 1500 bar. GyrA-proteinet renades genom nickelaffinitetskromatografi på en manuellt packad XK 26/20-kolonn (Pharmacia) med Chelating Sepharose 6 Fast Flow-harts (GE Healthcare) bunden till Ni2+-joner. Elueringen utfördes med lysisbuffert innehållande 250 mM imidazol pH 8,0 och de eluerade proteinerna fästes direkt på en 10 ml Streptavidin Sepharose (GE Healthcare). Proteinerna tvättades noggrant med Strep-buffert (20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 % v/v glycerol, pH 8,0) och eluerades med Strep-buffert som innehöll 3 mM Desthiobiotin (Sigma-Aldrich). Både 10-His-tagget och Twin-strep-tagget klyvdes därefter av PreScission proteas (P3C) och Tobacco Etch Virus (TEV) klyvning (massförhållande 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) över natten vid 4 °C. GyrA renades sedan ytterligare genom ett anjonbyteskromatografiskt steg med hjälp av en HiTrap Q HP-kolonn (GE Healthcare). Proteinet eluerades med en linjär gradient av 20 kolonnvolymer med buffert B (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 % v/v glycerol, pH 8,0). Fraktioner som innehöll GyrA sammanfördes och laddades på en Superdex S200 16/60-kromatografikolonn med storleksuteslutning (GE Healthcare) med 20 mM Hepes, 50 mM NaGlu, 50 mM KAc, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10 % v/v glycerol, pH 8,0. 37 mg GyrA erhölls från 3 l kulturer. Kodningssekvensen för GyrB (2-804) infogades i samma modifierade pET28b. Övexpressionen utfördes i E. coli BL21 (DE3) pRARE2 i LB-medium innehållande 50 µg/mL kanamycin och 35 µg/mL kloramfenikol. Cellerna inducerades med 0,35 mM IPTG efter att ha nått en OD600 på 0,85 och proteinet uttrycktes vid 18 °C under 18 timmar. 10 mg GyrB erhölls från 3 L kulturer.
Full DNA-gyrase rekonstitution
E. coli GyrA och GyrB blandades i ekvimolärt förhållande för att möjliggöra full DNA-gyrase rekonstitution. Komplexet renades vidare på en Superdex S200 16/60-kromatografikolonn med storleksuteslutande kromatografi (GE Healthcare) med hjälp av cryo-EM-buffert (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0,5 mM TCEP, pH 8,0) (Fig. 1 och kompletterande fig. 1).
Nukleinsyraberedning
En dubbelnickad 180 bp DNA-duplex rekonstruerades med hjälp av 2 fosforylerade asymmetriska syntetiska oligonukleotider12 som erhållits från Sigma-Aldrich (kompletterande tabell 1). Nukleinsyrorna löstes upp i 1 mM koncentration i DNAse-fritt vatten. För att bygga upp det dubbelsträngade DNA:t blandades varje oligonukleoid i molförhållandet 1:1, annealades genom inkubation vid 95 °C i 2 minuter och sedan sänktes temperaturen med 1 °C var 1 minut tills den nådde 20 °C. Den glödgade dubbelt nicked DNA-duplexen buffertbyttes sedan i Hepes 20 mM pH 8,0 med en BioSpin 6-kolonn (BioRad).
Komplexbildning för cryo-EM
Den renade DNA-gyrasen blandades med 180 bp dsDNA i ett molärt förhållande 1:1 med en slutlig protein- och DNA-koncentration på 32 µM. Blandningen inkuberades i 10 minuter vid 37 °C. Gepotidacin (GSK2140944, köpt på MedChemExpress) resuspenderat vid 10 mM i 100 % DMSO tillsattes för att nå en slutkoncentration på 170 µM (1,7 % DMSO). Blandningen inkuberades i 10 minuter vid 37 °C. AMP-PNP (Sigma) tillsattes till komplexet i en slutlig koncentration på 340 µM. Det fullständigt rekonstituerade komplexet inkuberades ytterligare 30 minuter vid 30 °C. Slutligen tillsattes 8 mM CHAPSO (Sigma-Aldrich) till komplexet. Provet centrifugerades 2 timmar vid 16 000 × g för att avlägsna eventuella aggregat.
Cryo-EM grid preparation
Quantifoil R-1.2/1.3 300 mesh kopparnät laddades med glödladdning i 20 sekunder innan 4 µl av komplexet applicerades. Efter 30 s inkubation frystes gallren ner i flytande etan med hjälp av en Vitrobot mark IV (FEI) med 95 % luftfuktighet i kammaren vid 10 °C.
Elektronmikroskopi
Kryo-EM-avbildning utfördes i ett Titan Krios-mikroskop som drevs vid 300 kV (FEI) och som var utrustat med en direktelektronkamera K2 Summit (Gatan), ett GIF Quantum-energifilter (Gatan) som drevs i nollenergiförlustläge med en spaltbredd på 20 e-V, en Volta-fasplatta (FEI) och en CS-korrektor (FEI). Bilderna registrerades i EFTEM-nanosondläge med Serial EM53 i superupplösande räkningsläge vid en nominell förstoring på 130 000x med en superupplösande pixelstorlek på 0,44 Å och ett konstant defokusmål på -500 nm (kompletterande fig. 2c). VPP:n flyttades fram till en ny position var 100:e minut (kompletterande fig. 2b). Fyra dataset samlades in med en doshastighet på 6 till 8 e-/pixel/s (0,88 Å pixelstorlek vid provet) på detektorn. Bilderna registrerades med en total dos på 50 e-/Å2, exponeringstid mellan 7 till 10 s och 0,2 till 0,25 s delbilder (35 till 50 totala bilder). Totalt 11 833 filmer spelades in efter datainsamling av de fyra datasetterna.
Databearbetning
Databearbetningen av varje dataset gjordes separat enligt samma förfarande fram till 3D-förfiningarna då partiklarna slogs samman. De superupplösta dosfraktionerade delbilderna förstärkningskorrigerades med IMOD54 och binnades två gånger genom Fourier-cropping, driftkorrigerades och dosvägdes med hjälp av MotionCor255 vilket gav summerade bilder med en pixelstorlek på 0,88 Å. Kontrastöverföringsfunktionen för de korrigerade mikrograferna uppskattades med hjälp av GCTF v1.0656. Thonringar inspekterades manuellt för astigmatism och mikrobilder med uppmätta upplösningar som var sämre än 4 Å kasserades, vilket gav 8 701 återstående mikrobilder. Partiklar plockades automatiskt med hjälp av ett referensfritt Gaussiskt protokoll för plockning av blobbar i RELION229,30. Sammanlagt valdes 1 572 962 partiklar ut ur de fyra datasetterna. Partiklar från varje datamängd som var fyra gånger indelad i bitar utsattes separat för två omgångar av 2D-klassificering i RELION2 för att avlägsna skräppartiklar och föroreningar, vilket resulterade i totalt 479 667 partiklar för vidare bearbetning. Partiklar från de fyra datasetterna slogs samman till ett unikt dataset följt av en ny extraktion med centrering i 3 × 3 binned format. En sista omgång 2D-klassificering utfördes sedan, vilket gav en slutlig partikelstapel med 338 616 partiklar. Den efterföljande partikelstapeln utsattes för en runda av 3D-ab-initio-klassificering i cryoSPARC31. Efter att ha kastat bort modellerna av dålig kvalitet resulterade den återstående ab-initio-modellen i en slutlig datamängd på 191 456 partiklar, med ett tröskelvärde för klassens sannolikhet på 0,9 (kompletterande fig. 2a). Ab-initio-modellen lågpassfiltrerades till 30 Å och användes som referens för homogen förfining i cryoSPARC vilket resulterade i en karta på 5,4 Å. De förfinade partikelkoordinaterna användes sedan för lokal CTF-skattning med hjälp av GCTF v1.06 följt av återextraktion av 2 × 2 binned-partiklar med centrering. Denna nya partikelstapel utsattes för en 3D-autoraffinering i RELION2 med hjälp av ab-initio-modellen som lågpassfiltrerades vid 30 Å, vilket gav en karta med en global upplösning på 5,0 Å (kompletterande fig. 3). Den lokala upplösningen visade ett upplösningsintervall från 4,0 Å i den DNA-bindande/avslitande kärnan till 9,0 Å i ATPase-domänen och GyrA β-hjulet som omsluter DNA:t, vilket tyder på hög flexibilitet hos dessa två moduler. För att få en slutlig rekonstruktion av hela komplexet med väldefinierade tätheter för varje domän utförde vi 3D-klassificering utan anpassning, vilket gav flera olika klasser. Partiklar från tre klasser slogs samman (94 633 partiklar). Den efterföljande 1 × 1-binnade partikelstapeln förfinades i RELION2 utan mask fram till sena förfiningsiterationer där en mjuk mask tillämpades för att förbättra upplösningen. Efterbearbetning av kartan gav en rekonstruktion med 6,6 Å upplösning av det totala komplexet (Supplementary Fig. 3).
En kombination av olika lokala tillvägagångssätt användes för att identifiera olika konformationer och för att förbättra den lokala upplösningen av varje domän. Eftersom ATPase-domänen var för liten för en fokuserad 3D-förfining utförde vi först en fokuserad 3D-klassificering av ATPase-domänen med en mjuk mask och ingen anpassning i RELION2. En klass med 58 329 partiklar med en väldefinierad täthet av ATPase-domänen valdes ut, följt av återextraktion av 1 × 1-binnade partiklar som gav partiklar med en pixelstorlek på 0,88 Å/pixel. För att underlätta en noggrann anpassning av partiklarna förfinades denna klass ytterligare i RELION2 med hjälp av en mjuk mask runt ATPase-domänen och DNA-bindnings-/spaltningsdomänen, vilket gav en karta med en global upplösning på 5,9 Å (ATPase-Core) (Supplementary Fig. 3).
För det andra utförde vi en fokuserad 3D-klassificering av GyrA β-stifthjulet med en mjuk mask och ingen anpassning i RELION2. En klass med 45 040 partiklar med en väldefinierad täthet av GyrA β-pinnhjulet valdes ut, följt av återextraktion av 1 × 1-binnade partiklar som gav partiklar med en pixelstorlek på 0,88 Å/pixel. Denna klass förfinades ytterligare i RELION2 med hjälp av en mjuk mask runt β-hjulet och DNA-bindnings-/spaltningsdomänen vilket gav en karta med en upplösning på 6,3 Å (CTD-Core) (Supplementary Fig. 3).
Slutligt utfördes en fokuserad 3D-autoraffinering i RELION2 med hjälp av en mjuk mask runt DNA-bindnings-/spaltningsdomänen. Efterbearbetning av kartan gav en rekonstruktion med 4,3 Å upplösning av DNA-bindnings-/cleavage-domänen. Därefter utfördes en fokuserad 3D-klassificering av DNA-bindnings- och klyvningsdomänen. Två av klasserna visade bättre vinkelnoggrannhet och tydliga slutna (60 548 partiklar) och föröppnande konformationer (53 655 partiklar) av DNA-bindnings-/cleavage-domänen. Dessa två klasser förfinades ytterligare i RELION2 genom fokuserad 3D-förfining med C2-symmetri med hjälp av 1 × 1 binned partiklar och gav rekonstruktioner med global upplösning på 4,0 respektive 4,6 Å efter efterbearbetning (kompletterande figur 3). Den slutna DNA-bindnings- och klyvningsdomänen förfinades ytterligare genom fokuserad 3D-förfining med hjälp av en mjuk mask, som utesluter den oordnade TOPRIM-insatsen, vilket gav en karta på 4,0 Å av hög kvalitet (kompletterande figur 3).
Alla rapporterade upplösningar är baserade på guldstandarden FSC-0,143-kriteriet57 och FSC-kurvorna korrigerades för konvolutionseffekterna av en mjuk mask med hjälp av högupplöst noise-substitution58 i RELION2 såväl som i cryoSPARC (kompletterande fig. 4a). Alla rekonstruktioner skärptes genom att tillämpa en negativ B-faktor som uppskattades med hjälp av automatiserade förfaranden59. Kartornas lokala upplösning beräknades med hjälp av Blocres60 (kompletterande figur 4c). Kryo-EM-kartorna över det totala komplexet, ATPas-kärnan, CTD-kärnan och den DNA-bindande/avslitande domänen i stängt tillstånd (med och utan TOPRIM-insättning) och i föröppnat tillstånd har deponerats i EM Data Bank under accessionsnumren EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909, EMD-4912, respektive.
Modelluppbyggnad och förfining
EM-rekonstruktionen av den DNA-bindande/spaltningsdomän som saknar TOPRIM-insatsen och som löstes vid 4,0 Å var av bästa kvalitet. Nästan alla sidokedjor kunde ses och Gepotidacindensiteten var tydligt synlig. Denna karta användes för att förfina en kristallstruktur av den DNA-bindande/spjälkningsdomänen hos E. coli DNA-gyrase17. En dimerisk atommodell av DNA-bindnings- och klyvningsdomänen genererades med hjälp av PDB 3NUH i PyMol (Schrodinger L.L.L.C.). I den efterföljande atomiska modellen avlägsnades de aminosyror som tillhör TOPRIM-insatsen, alla joner och vattenmolekyler, med alla ockupationer inställda på 1 och B-faktorer inställda på 50. Först anpassades den atomära modellen med rigida kroppar i den filtrerade och skärpta kartan med Chimera61. En första omgång förfining i verklig rymd i PHENIX62 utfördes med hjälp av lokal anpassning i verklig rymd och global gradientdriven minimeringsförfining. Därefter kopierades 20 nukleinsyror från strukturen av S. aureus DNA-gyrase41 (PDB 5IWM) och anpassades till vår atomära modell. DNA-sekvensen modifierades i enlighet med det DNA som användes i vår struktur. Saknade proteinrester och nukleinsyror byggdes in manuellt i COOT63. Atomisk modell och begränsningslexikon för gepotidacin (GSK-2140944) genererades med Grade-servern (http://grade.globalphasing.org). Gepotidacin anpassades sedan manuellt i den tomma elektrontätheten i COOT och duplicerades sedan. Båda duplikaten ställdes in på 0,5 beläggning. Flera omgångar av realrymdsförfining i PHENIX med hjälp av begränsningar för sekundärstruktur, rotamers, Ramachandran och icke-kristallografisk symmetri utfördes, alltid följt av manuell kontroll i COOT, tills en konvergerande modell erhölls. Slutligen förfinades B-faktorer genom en sista omgång förfining i realrymd i PHENIX med samma inställningar som tidigare. Efter att förfiningen konvergerat lades atomkoordinater för TOPRIM-insatsen till den atomära modellen. Den förfinades ytterligare i de EM-rekonstruktioner som innehöll insättningstätheten i slutna och föröppna tillstånd med samma förfarande. En korsvalidering av en halvmapp utfördes för att definiera 1,5 som den bästa förädlingsvikten i PHENIX som gör det möjligt att minska atomkollisioner och förhindra överanpassning av modellen (kompletterande fig. 4e). Alla förädlingssteg gjordes med hjälp av upplösningsgränsen för rekonstruktionerna enligt guldstandarden FSC-0.143-kriteriet57. Förfiningsparametrar, modellstatistik och valideringsresultat sammanfattas i kompletterande tabell 2. De atomära modellerna av E. coli DNA-bindnings-/spaltningsdomänen i slutna konformationer (med och utan insättning) och konformationer före öppning har deponerats i Protein Data Bank under accessionsnumren 6RKU, 6RKS respektive 6RKV.
För det övergripande komplexet använde vi en kombination av olika EM-rekonstruktioner för att bygga upp den atomära modellen för det övergripande komplexet av DNA-gyrase. ATPase-Core-strukturen som löstes vid 5,9 Å användes för att i Chimera rigid-body fitta ATPase-domänens kristallstruktur i komplex med ADPNP32 (PDB 1EI1) och DNA-bindnings-/cleavage-domänen som förfinats i sluten konformation. Kvaliteten på elektrontätheten gjorde det möjligt att i COOT bygga upp de saknade resterna i länken mellan ATPas-domänen och den DNA-bindande/avslitande domänen. CTD-Core-strukturen som löstes på 6,3 Å användes för att exakt anpassa β-pinwheel-kristallstrukturen10 i Chimera med hjälp av rigida kroppar. De 10 saknade aminosyrorna (564-574) efter GyrA-boxen lades till med hjälp av modelleringsservern Phyre264. Kvaliteten på den elektroniska tätheten gjorde det möjligt att i COOT bygga upp de saknade nukleinsyrorna runt β-hjulet samt de 10 aminosyror som förbinder de sista GyrA-resterna med β-hjulet. Baserat på en sekundärstrukturprediktion byggdes en del av länkern som en alfahelix (fig. 3). Den efterföljande atommodellen som innehöll ATPasdomänen, DNA-bindnings-/avbrytningsdomänen och ett β-pinnhjul anpassades med rigida kroppar till den övergripande komplexa strukturen som löstes vid 6,6 Å med hjälp av Chimera. Därefter anpassades en kopia av det första β-stifthjulet till det andra β-stifthjulets täthet i COOT. De saknade nukleinsyrorna runt det andra β-pinnhjulet samt de saknade 10 resterna i länkern byggdes in manuellt i COOT. Den resulterande atommodellen rensades från alla joner och vattenmolekyler, med alla ockupationer inställda på 1 och B-faktorer inställda på 50. Slutligen utfördes förfining av atommodellen i verklig rymd mot den övergripande komplexa strukturen i PHENIX med hjälp av förfining med rigida kroppar och global gradientdriven minimeringsförfining. Upplösningsgränsen för förfining fastställdes i enlighet med guldstandarden FSC-0.143-kriteriet57. Halva korsvalideringar av kartor utfördes också (kompletterande figur 4e). Förfiningsparametrar, modellstatistik och valideringsresultat sammanfattas i kompletterande tabell 2. Den atomära modellen av den övergripande strukturen har deponerats i Protein Data Bank under accessionnummer 6RKW. Alla figurer skapades med Chimera61, ChimeraX65 och PyMol (Schrodinger L.L.C.).
E. coli GyrB R286K, R286Q och E264A rening
Den modifierade pET28b som användes för vildtyp E. coli GyrB överexpression muterades genom platsriktad mutagenes med hjälp av QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent) för att generera tre plasmider med R286K-, R286Q- eller E264A-mutationer (kompletterande tabell 4). Överexpression och reningsförfaranden för de tre mutanterna är identiska med vildtypen GyrB som beskrivs ovan i avsnittet Metoder.
T. thermophilus GyrB K284R, K284Q rening
Den modifierade pET28b som användes för vildtyp T. thermophilus GyrB-överexpression12 muterades genom platsriktad mutagenes med hjälp av QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent) för att generera två plasmider med K284R- eller K284Q-mutationer (kompletterande tabell 4). Överuttryckning och reningsförfaranden för de två mutanterna är identiska med E. coli wild-type GyrB som beskrivs ovan i avsnittet Metoder.
DNA supercoiling assay
En ökande koncentration av DNA-gyrase (GyrA2B2) inkuberades vid 37 °C med 6 nM relaxerad pUC19-plasmid i en reaktionsblandning som innehåller 20 mM Tris-acetat pH 7,9, 100 mM kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 100 µg/ml BSA. Efter 30 minuter stoppades reaktionerna genom tillsats av SDS 1 %. Agarosgelelektrofores användes för att övervaka omvandlingen av avslappnad pUC19 till den superrullade formen. Proverna kördes på en 0,8 % agaros, 1X Tris Borate EDTA buffer (TBE) gel, vid 6 V/cm i 180 min i rumstemperatur. Agarosgelerna färgades med 0,5 mg/ml ethidiumbromid i 1X TBE i 15 min, följt av 5 min avfärgning i vatten. DNA-topoisomerer avslöjades med hjälp av en Typhoon (GE Healthcare).
ATPase activity assay
ATP-hydrolys mäts genom att följa oxidationen av NADH förmedlad av pyruvatkinas (PK) och laktatdehydrogenas (LDH). Absorptionen övervakades vid 340 nm under 600 s vid 37 °C med en Shimadzu 1700-spektrofotometer. Reaktionerna registrerades i tre exemplar med 50-100 nM GyrA2B2 och 16 nM linjärt DNA (pCR-blunt) i 500 µl av en buffert som innehåller 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM kaliumacetat, 8 mM magnesiumacetat, 7 mM BME, 100 µg/mg BSA, 4U/5U PK/LDH-blandning, 2 mM PEP och 0.2 mM NADH.
Multiple alignment and evolutionary conservation of residues
GyrB ATPase/Transducer protein sequences from 30 species (Uniprot codes: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens; Q83FD5_COXBU, Coxiella burnetii; GYRB_ECOLI, Escherichia coli; GYRB_NEIGO, Neisseria gonorrhoeae; GYRB_SALTY, Salmonella typhimurium; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa, Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile, GYRB_RICFE, Rickettsia felis, Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis, GYRB_BORBU; Borrelia burgdorferi; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis; GYRB_THEMA, Thermotoga maritima; GYRB_THET8, Thermus thermophilus; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) anpassades med hjälp av Clustal Omega-servern (EMBL-EBI). Den efterföljande anpassningen användes för att kartlägga den evolutionära bevaringen av aminosyrorna på ATPase/transducerstrukturen (PDB ID 1EI1) med hjälp av ConSurf-servern (http://consurf.tau.ac.il). Det fylogenetiska trädet genererades med hjälp av grannföreningsmetoden med hjälp av den multipla anpassningen i Clustal Omega.
Rapporteringssammanfattning
Fördjupad information om forskningens utformning finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till den här artikeln.