Ames Test er en biologisk test til vurdering af kemiske forbindelsers mutagene potentiale. Den anvender bakterier til at teste, om et givet kemikalie kan forårsage mutationer i testorganismens DNA. Testen blev udviklet af Bruce N. Ames i 1970’erne for at afgøre, om et foreliggende kemikalie er mutagent.
Mål
Afgøre den mutagene aktivitet af kemikalier ved at observere, om de forårsager mutationer i prøvebakterier.
Princip
- Ames-testen anvender flere bakteriestammer (Salmonella, E.coli), der bærer en bestemt mutation.
- Punktmutationer foretages i histidin- (Salmonella typhimurium) eller tryptofanoperonet (Escherichia coli), hvilket gør bakterierne ude af stand til at producere den tilsvarende aminosyre.
- Disse mutationer resulterer i his- eller trp- organismer, der ikke kan vokse, medmindre der tilføres histidin eller tryptofan.
- Men dyrkning af His- Salmonella er i et medie, der indeholder visse kemikalier, forårsager mutation i det histidin-kodende gen, således at de genvinder evnen til at syntetisere histidin (His+). Det vil sige, at når der sker en mutagen hændelse, kan basesubstitutioner eller frameshifts i genet forårsage en tilbagevenden til aminosyreprototrofi. Dette er den omvendte mutation.
- Disse reverterede bakterier vil derefter vokse i henholdsvis histidin- eller tryptofanfattige medier.
En prøves mutagene potentiale vurderes ved at udsætte aminosyrekrævende organismer for varierende koncentrationer af kemiske stoffer og udvælge for reversionshændelsen. Til denne udvælgelse anvendes medier, der mangler den specifikke aminosyre, og som kun tillader de celler, der har gennemgået reversionen til histidin/tryptofan-prototrofi, at overleve og vokse. Hvis testprøven forårsager denne reversion, er den et mutagen.
Metode
I ) Isolér en auxotrof stamme af Salmonella Typhimurium for histidin. (dvs. His-ve)
II) Fremstil en testsuspension af His-ve Salmonella Typhimurium i en almindelig buffer med testkemikalie (f.eks. 2-aminofluoren). Tilsæt også en lille mængde histidin.
Note: Der kræves en lille mængde histidin, så bakterierne begynder at vokse. Når histidin er udtømt, er det kun de bakterier, der er muteret til at få evnen til at syntetisere histidin, der danner kolonier.
III) Fremstil også en kontrolsuspension af His-ve Salmonella Typhimurium, men uden testkemikalier.
IV) Inkubér suspensionerne ved 37 °C i 20 minutter
V) Forbered de to agarplader og spred suspensionen på agarpladen.
VI) Inkubér pladerne ved 37 °C i 48 timer.
VII) Efter 48 timer tælles antallet af kolonier på hver plade.
Resultattolkning
- Kemikaliernes mutagenicitet er proportional med antallet af observerede kolonier.
- Hvis der er et stort antal kolonier på testpladen i forhold til kontrolpladen, siges sådanne kemikalier at være mutagene.
- Der kan også ses et meget lille antal kolonier på kontrolpladen. Dette kan skyldes en spontan punktmutation på det gen, der koder for hisidin.
Anvendelser
Mens Ames-testen anvendes til at identificere de revertmutationer, der er til stede i stammer, kan den også anvendes til at påvise mutageniciteten af miljøprøver såsom lægemidler, farvestoffer, reagenser, kosmetik, spildevand, pesticider og andre stoffer, som let opløses i en flydende suspension.
Merits
- Enkle, hurtige og robuste bakterieanalyser.
- Testens lethed og lave omkostninger gør den uvurderlig til screening af stoffer i vores miljø for mulig carcinogenicitet.
- Ames-testen kan påvise egnede mutanter i store bakteriepopulationer med høj følsomhed.
Begrænsninger
- Nogle stoffer, der forårsager kræft hos forsøgsdyr (f.eks. dioxin), giver ikke en positiv Ames-test (og omvendt)
- Ames-testen består af Salmonella typhimurium-stammer, og den er derfor ikke en perfekt model for mennesker.