Forelæsningsindhold
Indledning
Den sekretoriske vej i eukaryote celler bruges til at sende proteiner og lipider til plasmamembranen og visse membranbundne organeller og til at frigive materiale uden for cellen. Der findes to typer sekretion: konstitutiv og reguleret sekretion. Konstitutiv sekretion er standardvejen og bruges primært til at genopfylde materiale ved plasmamembranen og visse membranbundne organeller. Den regulerede sekretion ender i sekretoriske vesikler, der opbevarer det sekretede materiale, indtil et signal udløser fusion med plasmamembranen. Begge typer sekretion anvender den samme vej, men signalsekvenser leder proteinerne over i den regulerede vej. Cellerne henter også materiale fra plasmamembranen gennem endocytose. Dette materiale kan enten genanvendes til plasmamembranen eller nedbrydes i lysosomet.
Principper for den sekretoriske vej
Proteiner og lipider syntetiseres i ER og transporteres derefter til Golgi. Proteinerne sorteres i Golgi og sendes til plasmamembranen, lysosomet eller sekretoriske vesikler. Transport af protein og lipid mellem membranbundne kompartmenter formidles af vesikler, der springer ud af et kompartment og derefter smelter sammen med det efterfølgende kompartment. Rabs, tethers og SNARE’er øger sandsynligheden for, at vesiklerne fusionerer med den rigtige målmembran. Cellerne opretholder integriteten og funktionaliteten af ER og Golgi ved at hindre, at residente proteiner kommer ind i vesiklerne, og ved at hente de proteiner, der undslipper.
Glykosylering
Glykosylering er den kovalente tilknytning af sukkerstoffer til proteiner, som sker for de fleste proteiner i ER. Glykosylering hjælper proteiner med at folde sig, målretter proteiner til specifikke organeller (f.eks. lysosom) og hæmmer proteolyse. Desuden er mange proteiner på celleoverfladen og i den ekstracellulære matrix, der omgiver cellerne, stærkt glykosylerede med henblik på en række biologiske formål.
N-linked glykosylering forekommer i ER og indebærer tilføjelse af en gruppe på 14 sukkerstoffer til aminegruppen i asparaginer. Grupperne indeholder en blanding af N-acetylglucosamin, mannose og glukose. Glukoseresterne fjernes i ER, inden proteinet transporteres til Golgi. I Golgi kan sukker-sidekæderne modificeres yderligere ved fjernelse og tilføjelse af forskellige sukkerstoffer.
O-linked glycosylering er den anden form og indebærer tilføjelse af sukkerstoffer til seriner eller threoniner. O-linked glycosylering starter sandsynligvis i Golgi ved tilføjelse af et enkelt sukkerstof. Andre enzymer tilføjer sukkerstoffer i grupper af to, og sukker-sidekæderne kan blive ekstremt lange.
Golgi-komplekset er en stak af membrancisterner med unikke biokemiske sammensætninger. Cisternerne betegnes normalt som cis-, medial-, trans- og trans-Golgi-netværk, hvor protein kommer ind i cis fra ER og ud fra TGN. Cisternerne synes at indeholde et unikt sæt enzymer, der modificerer sukker sidekæderne på proteiner. F.eks. fjernes mannose primært i den mediale cisterne, mens galactose tilføjes i den trans-cisterne.
Vesikulær transport
Transport mellem membranafdelinger formidles af små vesikler. Vesiklerne indeholder en proteinkappe, der driver vesikeldannelsen og rekrutterer proteiner ind i vesiklerne. Vesiklerne er målrettet mod det korrekte rum ved hjælp af en kombination af Rab-proteiner og SNARE’er. Rabs er en stor familie af små GTP-bindende proteiner, og hvert membranrum i sekretionsvejen synes at indeholde et unikt Rab-protein. SNARE’er er proteiner på vesikler og membranrum, som danner par for at formidle fusion. SNARE’er udgør en anden stor familie af proteiner, og forskellige kompartmenter indeholder sandsynligvis unikke SNARE-proteiner.
Vesikeldannelse
Formation af vesikler fra ER er mest klart forstået og vil tjene som et eksempel på, hvordan vesikler dannes. Mekanismen er sandsynligvis den samme for andre kompartmenter. Samling af en proteinkappe driver dannelsen, og kappens samling starter med bindingen af det lille GTP-bindende protein Sar1. Sar1-GTP associerer sig med ER og indsætter en lille helix i det ydre blad af ER-membranens dobbeltlag for at indlede en krumning af membranen. Sar1-GTP rekrutterer to andre sæt proteiner, der udgør vesikelkappen: Sec23-Sec24-komplekset, der binder til lastproteiner, og Sec13-Sec31-komplekset, der er med til at drive vesikeldannelsen. Valg af last for de fleste proteiner kræver en signalsekvens, der interagerer med Sec23-24-komplekset. Opløselige proteiner i lumen af ER’s lumen associeres med fragtreceptorer, som indeholder en signalsekvens, der binder Sec23-Sec24. Det kappekompleks, der omgiver vesikler fra ER, kaldes COP II.
Targeting Vesicles to Correct Compartment
To sæt af proteiner synes at hjælpe vesikler med at fusionere med den korrekte målmembran. Det ene sæt omfatter tethers, der lokaliseres til målmembranrummene og interagerer med komponenterne i vesikelkappen. Flere forskellige tethers er blevet identificeret i celler, og de synes hver især at lokalisere sig til et bestemt rum. Tethers danner strukturer, der strækker sig væk fra membranen i cytosolen. Dette kan hjælpe tethers med at interagere med vesikler, der ankommer fra det foregående membrankompartment.
Et andet sæt af proteiner, der hjælper med at målrette vesikler korrekt til den rette membran, er SNARE’erne. SNAREs medierer også fusion mellem membraner. Vesikler indeholder ét SNARE-protein (vSNARE) og membranrum indeholder 2 til 3 SNARE-proteiner (tSNAREs). SNARE-proteiner på vesikler og membranrum interagerer med specificitet. Dyreceller udtrykker 35 forskellige SNARE-proteiner, men kun visse sæt af SNARE’er interagerer med hinanden. Ved at lokalisere de SNARE’er, der kun interagerer på vesikler og deres målmembran, sikrer cellerne, at vesikler fusionerer til deres korrekte målmembran.
Membranfusion
SNARE-proteiner formidler fusion mellem vesikler og deres målmembrankompartment. SNARE-proteiner indeholder lange regioner, der danner spiralformede strukturer. De helikale domæner i vSNARE’er og tSNARE’er interagerer og ser ud til at lynlåse op. Den energi, der frigøres ved fuldstændig parring af vSNARE’er og tSNARE’er, menes at drive fusion mellem vesikelmembranen og membranen i rummene, selv om den nøjagtige mekanisme fortsat er uklar.
Nogle vesikler docker op på deres målmembran, men fusionerer ikke. For eksempel lagrer sekretoriske vesikler proteiner og andre små molekyler, indtil cellen får et signal om at frigive dem. Nogle sekretoriske vesikler docker til plasmamembranen gennem interaktion mellem vSNAREs og tSNAREs, men SNAREs er forhindret i at parre sig fuldstændigt for at drive membranfusion. Eksterne signaler udløser ophævelse af parringshæmningen, så vesiklerne kan fusionere med plasmamembranen.
Proteinsortering i trans-Golgi-netværket
Når de når frem til trans-Golgi-netværket, er de fleste proteiner målrettet mod deres endelige destination. Standardvejen synes at være transport til plasmamembranen, da plasmamembranen løbende skal udskifte lipider og proteiner. Andre proteiner bliver sorteret til lysosomer og sekretoriske vesikler. Signalet til at sende et protein til lysosomet involverer sukkersidekæden. De fleste lysosomale proteiner indeholder mannose-6-fosfat, som tilsættes i cis-Golgi. Den receptor, der binder mannose-6-fosfat, befinder sig i trans-Golgi-netværket og rekrutterer coat-proteiner til trans-Golgi-netværket. Clathrin danner kappen omkring disse vesikler, og vesiklerne ophober lysosomale proteiner, inden de springer ud af trans-Golgi-netværket. Disse vesikler smelter sammen med endosomer. Endosomernes lumen har en lav pH-værdi, hvilket får mannose-6-fosfatreceptoren til at adskille sig fra lysosomale proteiner. Mannose-6-fosfatreceptoren returneres til trans-Golgi-netværket, og vesiklen, der indeholder de lysosomale proteiner, modnes til et funktionelt lysosom.
Somme proteiner sorteres i sekretoriske vesikler, der opbevarer disse proteiner, indtil cellen får signal om at frigive dem. Mekanismen for, hvormed proteinerne sorteres i sekretoriske vesikler, da disse proteiner ikke deler en fælles sorteringssignalsekvens.
Endocytose
Cellerne frigiver ikke kun materiale til det ydre miljø, men optager også materiale uden for plasmamembranen gennem endocytose. Der findes flere former for endocytose.
Fagocytose gør det muligt for nogle celler (makrofager, neutrofiler) at opsluge og optage store partikler såsom mikroorganismer og døde celler. Fagocytose indebærer, at plasmamembranen trækkes frem omkring partiklen. Protrusionen drives af actinpolymerisation. Plasmamembranen omslutter til sidst partiklen og smelter sammen for at omslutte den fuldstændigt og danne en stor endocytisk vesikel.
Pinocytose danner meget mindre vesikler (~ 100 nm) og gør det muligt for cellerne at optage små mængder ekstracellulær væske og dele af plasmamembranen. En form for pinocytose er clathrinmedieret endocytose, der gør det muligt for celler at optage specifikke proteiner fra celleoverfladen.
Clathrinmedieret endocytose begynder med dannelsen af pit i plasmamembranen. Pit er omgivet på den cytoplasmatiske side af adaptorproteiner, der binder clathrin til pit. Adaptorerne interagerer også med proteiner i plasmamembranen, som er mål for endocytose. Pit kan rumme ~ 1000 proteiner. Polymerisering af clathrin driver dannelsen af en vesikel, som til sidst afklemmer sig fra plasmamembranen. GTPasen dynamin katalyserer afklemningsreaktionen. De clathrinbelagte vesikler smelter sammen med endosomer, hvor den lave pH-værdi dissocierer ligander fra receptorer. Nogle proteiner returneres derefter til plasmamembranen, mens andre målrettes til lysosomet, hvor de nedbrydes.