GyrB og GyrA ekspression og oprensning
Sekvensen, der koder for den fulde længde E. coli GyrA (2-875), blev indsat i et modificeret pET28b indeholdende et N-terminalt 10-His tag og et C-terminalt Twin-strep tag. Overekspression blev udført i E. coli BL21 (DE3) pRARE2 i LB-medium indeholdende 50 µg/mL kanamycin og 35 µg/mL chloramphenicol. Cellerne blev induceret med 0,35 mM IPTG efter at have nået en OD600 på 0,85, og proteinet blev udtrykt ved 37 °C i 4 timer. Cellerne blev høstet og resuspenderet i lysisbuffer (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, 10 % v/v glycerol, pH 8,0) og lyseret med tre cyklusser af højtryksdisruption ved hjælp af EmulsiFlex-C3 ved 1500 bar. GyrA-proteinet blev oprenset ved nikkel-affinitetskromatografi på en manuelt pakket XK 26/20-kolonne (Pharmacia) med Chelating Sepharose 6 Fast Flow-harpiks (GE Healthcare) bundet til Ni2+-ioner. Elueringen blev udført med lysisbuffer indeholdende 250 mM imidazol pH 8,0, og de eluerede proteiner blev direkte bundet på en 10 ml streptavidin-sefarose (GE Healthcare). Proteinerne blev vasket grundigt med Strep-buffer (20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 % v/v glycerol, pH 8,0) og elueret med Strep-buffer indeholdende 3 mM Desthiobiotin (Sigma-Aldrich). Både 10-His-tag og Twin-strep-tag blev efterfølgende spaltet af PreScission protease (P3C) og Tobacco Etch Virus (TEV) spaltning (masseforhold 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) natten over ved 4 °C. GyrA blev derefter yderligere oprenset ved et anionbytningskromatografisk trin ved hjælp af en HiTrap Q HP-kolonne (GE Healthcare). Proteinet blev elueret med en lineær gradient på 20 kolonnevolumener med buffer B (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 % v/v glycerol, pH 8,0). Fraktioner, der indeholdt GyrA, blev samlet og indlæst på en Superdex S200 16/60 size-exclusion-kromatografikolonne (GE Healthcare) med 20 mM Hepes, 50 mM NaGlu, 50 mM KAc, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10 % v/v glycerol, pH 8,0. Der blev fremstillet 37 mg GyrA fra 3 L kulturer. GyrB (2-804)-kodningssekvensen blev indsat i den samme modificerede pET28b. Overekspression blev udført i E. coli BL21 (DE3) pRARE2 i LB-medium indeholdende 50 µg/mL kanamycin og 35 µg/mL chloramphenicol. Cellerne blev induceret med 0,35 mM IPTG efter at have nået en OD600 på 0,85, og proteinet blev udtrykt ved 18 °C i 18 timer. GyrB-oprensningsproceduren er som beskrevet ovenfor for GyrA. Der blev fremstillet 10 mg GyrB fra 3 L kulturer.
Fuld DNA-gyrase rekonstituering
E. coli GyrA og GyrB blev blandet i et ækvimolært forhold for at muliggøre fuld DNA-gyrase rekonstituering. Komplekset blev yderligere oprenset på en Superdex S200 16/60 size-exclusion-kromatografikolonne (GE Healthcare) ved hjælp af cryo-EM-buffer (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0,5 mM TCEP, pH 8,0) (Fig. 1 og Supplerende fig. 1).
Nukleinsyrepræparering
Et dobbelt-nicked 180 bp DNA-duplex blev rekonstitueret ved hjælp af 2 fosforylerede asymmetriske syntetiske oligonukleotider12, der er opnået fra Sigma-Aldrich (Supplerende tabel 1). Nukleinsyrerne blev kort fortalt opløst i DNAsefrit vand i en koncentration på 1 mM. For at samle det dobbeltstrengede DNA blev hver oligo blandet i et molforhold på 1:1, annealeret ved inkubation ved 95 °C i 2 minutter og derefter sænket temperaturen med 1 °C hvert 1 minut, indtil den nåede 20 °C. Det annealerede dobbeltnickede DNA-duplex blev derefter bufferudskiftet i Hepes 20 mM pH 8,0 med en BioSpin 6-kolonne (BioRad).
Kompleksdannelse til cryo-EM
Den rensede DNA-gyrase blev blandet med 180 bp dsDNA i et molforhold på 1:1 med en endelig protein- og DNA-koncentration på 32 µM. Blandingen blev inkuberet i 10 minutter ved 37 °C. Gepotidacin (GSK2140944, købt hos MedChemExpress) resuspenderet ved 10 mM i 100 % DMSO blev tilsat for at nå en slutkoncentration på 170 µM (1,7 % DMSO). Blandingen blev inkuberet i 10 minutter ved 37 °C. AMP-PNP (Sigma) blev tilsat til komplekset i en slutkoncentration på 340 µM. Det fuldt rekonstituerede kompleks blev yderligere inkuberet 30 min. ved 30 °C. Endelig blev der tilsat 8 mM CHAPSO (Sigma-Aldrich) til komplekset. Prøven blev centrifugeret 2 timer ved 16.000 × g for at fjerne potentielle aggregater.
Cryo-EM gitterforberedelse
Quantifoil R-1.2/1.3 300 mesh kobbergitter blev glødeladet i 20 s før påføring af 4 µl af komplekset. Efter 30 sekunders inkubation blev gitterene dybfrosset i flydende ethan ved hjælp af en Vitrobot mark IV (FEI) med 95 % luftfugtighed i kammeret ved 10 °C.
Elektronmikroskopi
Kryo-EM-billeddannelse blev udført på et Titan Krios-mikroskop drevet ved 300 kV (FEI) udstyret med et K2 Summit direkte elektronkamera (Gatan), et GIF Quantum-energifilter (Gatan) drevet i nul-energitab-tilstand med en spaltebredde på 20 e-V, en Volta-faseplade (FEI) og en CS-korrektor (FEI). Billeder blev optaget i EFTEM-nanosondetilstand med Serial EM53 i superopløsningsoptællingstilstand ved en nominel forstørrelse på 130 000x med en superopløsnings-pixelstørrelse på 0,44 Å og et konstant defokusmål på -500 nm (Supplerende fig. 2c). VPP’en blev fremskudt til en ny position hver 100 min. (Supplerende fig. 2b). Der blev indsamlet fire datasæt med en dosishastighed på 6 til 8 e-/pixel/s (0,88 Å pixelstørrelse ved prøven) på detektoren. Der blev optaget billeder med en samlet dosis på 50 e-/Å2 , eksponeringstid mellem 7 og 10 s og 0,2 til 0,25 s subframes (35 til 50 frames i alt). Der blev i alt optaget 11 833 film efter dataindsamling af de 4 datasæt.
Databehandling
Databehandlingen af hvert datasæt blev udført separat efter den samme procedure indtil 3D-forfiningerne, hvor partiklerne blev slået sammen. De superopløselige dosisfraktionerede subframes blev gain-korrigeret med IMOD54 og binned to gange ved Fourier-cropping, driftkorrigeret og dosisvægtet ved hjælp af MotionCor255 , hvilket gav summerede billeder med 0,88 Å pixelstørrelse. Kontrastoverførselsfunktionen for de korrigerede mikrobilleder blev estimeret ved hjælp af GCTF v1.0656. Thonringe blev manuelt inspiceret for astigmatisme, og mikrobilleder med målte opløsninger, der var dårligere end 4 Å, blev kasseret, hvilket gav 8 701 tilbageværende mikrobilleder. Partikler blev automatisk udvalgt ved hjælp af en referencefri Gaussian blob picking-protokol i RELION229,30. Ved at tage de fire datasæt sammen blev der i alt udvalgt 1 572 962 partikler. Partikler fra hvert datasæt blev fire gange inddelt og separat underkastet to runder af 2D-klassifikation i RELION2 for at fjerne junkpartikler og forureninger, hvilket resulterede i i alt 479 667 partikler til videre behandling. Partikler fra de fire datasæt blev slået sammen til ét unikt datasæt efterfulgt af en ny udtrækning med centrering i 3 × 3 binned-format. Derefter blev der foretaget en sidste runde af 2D-klassificering, hvilket gav en endelig partikelstakke på 338 616 partikler. Den efterfølgende partikelstakke blev underkastet en runde 3D-ab-initio-klassifikation i cryoSPARC31. Efter at have kasseret de modeller af dårlig kvalitet resulterede den resterende ab-initio-model i et endeligt datasæt på 191 456 partikler med en klassesandsynlighedstærskel på 0,9 (Supplerende figur 2a). Ab-initio-modellen blev lavpasfiltreret til 30 Å og blev brugt som reference for homogen raffinering i cryoSPARC, hvilket resulterede i et 5,4 Å-kort. De raffinerede partikelkoordinater blev derefter brugt til lokal CTF-estimation ved hjælp af GCTF v1.06 efterfulgt af genudtrækning af 2 × 2 binned-partikler med centrering. Denne nye partikelstakke blev underkastet en 3D-autoraffinering i RELION2 ved hjælp af ab-initio-modellen, der blev lavpasfiltreret ved 30 Å, hvilket gav et kort med en global opløsning på 5,0 Å (supplerende fig. 3). Den lokale opløsning viste et opløsningsområde fra 4,0 Å i DNA-binding/spaltningskernen til 9,0 Å i ATPase-domænet og GyrA β-pinhjulet, der omslutter DNA’et, hvilket indikerer en høj fleksibilitet i disse to moduler. For at opnå en endelig rekonstruktion af det fulde kompleks med veldefinerede tætheder for hvert domæne udførte vi en 3D-klassifikation uden alignment, hvilket gav flere forskellige klasser. Partikler fra tre klasser blev slået sammen (94.633 partikler). Den efterfølgende 1 × 1-binned partikelstakke blev raffineret i RELION2 uden maske indtil de sene raffineringsiterationer, hvor der blev anvendt en blød maske for at forbedre opløsningen. Efterbehandling af kortet gav en 6,6 Å opløsningsrekonstruktion af det samlede kompleks (Supplerende fig. 3).
En kombination af forskellige lokale tilgange blev anvendt til at identificere forskellige konformationer og til at forbedre den lokale opløsning af hvert domæne. Da ATPase-domænet var for lille til en 3D-fokuseret raffinering, udførte vi først en fokuseret 3D-klassificering af ATPase-domænet med en blød maske og ingen justering i RELION2. En klasse på 58 329 partikler med en veldefineret tæthed af ATPase-domænet blev udvalgt, efterfulgt af genudtrækning af 1 × 1-binned partikler, hvilket gav partikler med en pixelstørrelse på 0,88 Å/pixel. For at lette en nøjagtig justering af partiklerne blev denne klasse yderligere raffineret i RELION2 ved hjælp af en blød maske omkring ATPase-domænet og DNA-bindings-/spaltningsdomænet, hvilket gav et kort med en global opløsning på 5,9 Å (ATPase-Core) (Supplerende fig. 3).
For det andet udførte vi en fokuseret 3D-klassifikation af GyrA β-pinhjulet med en blød maske og ingen justering i RELION2. En klasse på 45 040 partikler med en veldefineret tæthed af GyrA β-pinwheel blev udvalgt, efterfulgt af genudtrækning af 1 × 1-binned partikler, hvilket gav partikler med en pixelstørrelse på 0,88 Å/pixel. Denne klasse blev yderligere forfinet i RELION2 ved hjælp af en blød maske omkring β-pinwheel og DNA-binding/spaltningsdomænet, hvilket gav et kort med en opløsning på 6,3 Å (CTD-Core) (Supplerende fig. 3).
Finalt blev der udført en fokuseret 3D-autoraffinering i RELION2 ved hjælp af en blød maske omkring DNA-binding/spaltningsdomænet. Efterbehandling af kortet producerede en 4,3 Å opløsningsrekonstruktion af DNA-bindings-/spaltningsdomænet med en opløsning på 4,3 Å. Derefter blev der foretaget en fokuseret 3D-klassifikation af DNA-bindings-/spaltningsdomænet. To af klasserne viste bedre vinkelpræcisioner og tydelige lukkede (60 548 partikler) og præ-åbnings-konformationer (53 655 partikler) af DNA-bindings-/spaltningsdomænet. Disse to klasser blev yderligere forfinet i RELION2 ved fokuseret 3D-forfining med en C2-symmetri ved hjælp af 1 × 1 binned partikler og gav rekonstruktioner med en global opløsning på henholdsvis 4,0 og 4,6 Å efter efterbehandling (Supplerende fig. 3). Det lukkede DNA-bindings-/spaltningsdomæne blev yderligere raffineret ved fokuseret 3D-forfining ved hjælp af en blød maske, som udelukker den uordnede TOPRIM-indsættelse, hvilket gav et 4,0 Å-kort af høj kvalitet (Supplerende fig. 3).
Alle rapporterede opløsninger er baseret på guldstandarden FSC-0,143-kriteriet57 , og FSC-kurverne blev korrigeret for konvolutionseffekterne af en blød maske ved hjælp af højopløsningsstøjsubstitution58 i RELION2 såvel som i cryoSPARC (Supplerende fig. 4a). Alle rekonstruktioner blev skærpet ved at anvende en negativ B-faktor, der blev estimeret ved hjælp af automatiserede procedurer59. Lokal opløsning af kort blev beregnet ved hjælp af Blocres60 (Supplerende figur 4c). Kryo-EM-kortene af det samlede kompleks, ATPase-kernen, CTD-kernen og DNA-bindings-/spaltningsdomænet i lukket tilstand (med og uden TOPRIM-indsættelse) og i præ-åbningstilstand er blevet deponeret i EM Data Bank under henholdsvis EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909 og EMD-4912.
Modelopbygning og forfining
EM-rekonstruktionen af det DNA-bindende/spaltningsdomæne, der mangler TOPRIM-indsættelsen, løst ved 4,0 Å, var af den bedste kvalitet. Næsten alle sidekæder kunne ses, og Gepotidacindensiteten var tydeligt synlig. Dette kort blev brugt til at forfine en krystalstruktur af DNA-bindings-/spaltningsdomænet af E. coli DNA-gyrase17. En dimer atomisk model af DNA-bindings-/spaltningsdomænet blev genereret ved hjælp af PDB 3NUH i PyMol (Schrodinger L.L.L.C.). Den efterfølgende atomare model blev renset for aminosyrer, der hører til TOPRIM-indsættelsen, alle ioner og vandmolekyler, med alle besættelser sat til 1 og B-faktorer sat til 50. Først blev den atomare model rigid-body fitted i det filtrerede og skærpede kort med Chimera61 . En første runde af realrumsforfining i PHENIX62 blev udført ved hjælp af lokal realrumsindpasning og global gradientdrevet minimeringsforfining. Derefter blev 20 nukleinsyrer fra strukturen af S. aureus DNA-gyrase41 (PDB 5IWM) kopieret og indpasset i vores atomare model. DNA-sekvensen blev ændret i overensstemmelse med det DNA, der blev anvendt i vores struktur. Manglende proteinrester og nukleinsyrer blev manuelt bygget op i COOT63. Atomic model og constraint dictionary af gepotidacin (GSK-2140944) blev genereret med Grade-serveren (http://grade.globalphasing.org). Gepotidacin blev derefter manuelt indpasset i den tomme elektrontæthed i COOT og derefter duplikeret. Begge dubletter blev indstillet til 0,5 belægning. Der blev udført flere runder af real space refinement i PHENIX ved hjælp af begrænsninger for sekundærstruktur, rotamere, Ramachandran og ikke-krystallografisk symmetri, altid efterfulgt af manuel inspektion i COOT, indtil der blev opnået en konvergerende model. Endelig blev B-faktorer raffineret ved en sidste runde af realrumsraffinering i PHENIX med de samme indstillinger som tidligere. Efter at raffineringen er konvergeret, blev atomkoordinaterne for TOPRIM-indsættelsen tilføjet til den atomare model. Den blev yderligere forfinet i EM-rekonstruktioner, der indeholder indsættelsestætheden i lukkede og præ-åbne tilstande, ved hjælp af samme procedure. Der blev udført en halv kort krydsvalidering for at definere 1,5 som den bedste forfiningsvægt i PHENIX, der muliggør reduktion af atomkonflikter og forhindring af overtilpasning af modellen (Supplerende figur 4e). Alle raffineringstrin blev udført ved hjælp af opløsningsgrænsen for rekonstruktioner i henhold til guldstandarden FSC-0.143-kriteriet57. Forfiningsparametre, modelstatistikker og valideringsscorer er opsummeret i Supplerende tabel 2. De atomare modeller af E. coli DNA-bindings-/spaltningsdomænet i lukkede (med og uden indsættelse) og præ-åbnings-konformationer er blevet deponeret i Protein Data Bank under accessionsnumrene 6RKU, 6RKS, 6RKV, henholdsvis.
For det samlede kompleks brugte vi en kombination af forskellige EM-rekonstruktioner til at opbygge den atomare model af DNA-gyrase samlede kompleks. ATPase-kernestrukturen, der er løst ved 5,9 Å, blev brugt til rigid-body fit i Chimera af ATPase-domænets krystalstruktur i kompleks med ADPNP32 (PDB 1EI1) og DNA-bindings-/spaltningsdomænet raffineret i lukket konformation. Kvaliteten af elektrontætheden gjorde det muligt i COOT at opbygge de manglende rester af forbindelsesleddet mellem ATPase-domænet og DNA-bindings-/spaltningsdomænet. CTD-Core-strukturen, der er løst ved 6,3 Å, blev anvendt til nøjagtig rigid-body fitning af β-pinwheel-krystalstrukturen10 i Chimera. De 10 manglende aminosyrer (564-574) efter GyrA-boxen blev tilføjet ved hjælp af modelleringsserveren Phyre264. Kvaliteten af den elektroniske tæthed gjorde det muligt i COOT at opbygge de manglende nukleinsyrer omkring β-pinhjulet samt de 10 aminosyrer, der forbinder de sidste GyrA-rester med β-pinhjulet. På grundlag af en forudsigelse af sekundærstrukturen blev en del af linkeren bygget som en alfa-helix (fig. 3). Den efterfølgende atomare model, der indeholder ATPase-domænet, DNA-bindings-/spaltningsdomænet og et β-pinwheel, blev rigid-body fitted ind i den samlede kompleksstruktur, der blev løst ved 6,6 Å ved hjælp af Chimera. Derefter blev en kopi af det første β-stifthjul indpasset i tætheden af det andet β-stifthjul i COOT. De manglende nukleinsyrer omkring det andet β-pinwheel samt de manglende 10 rester af linkeren blev manuelt bygget op i COOT. Den resulterende atomare model blev renset for alle ioner og vandmolekyler, med alle belægninger sat til 1 og B-faktorer sat til 50. Endelig blev den atomare model raffineret i det virkelige rum i forhold til den samlede komplekse struktur i PHENIX ved hjælp af rigid-body- og global gradient-drevet minimeringsforfining. Opløsningsgrænsen for raffinering blev fastsat i overensstemmelse med guldstandarden FSC-0.143-kriteriet57. Der blev også udført halvmap-krydsvalideringer (supplerende fig. 4e). Forfiningsparametre, modelstatistik og valideringsscore er opsummeret i supplerende tabel 2. Den atomare model af den samlede struktur er blevet deponeret i Protein Data Bank under accessionsnumre 6RKW. Alle figurer blev oprettet med Chimera61, ChimeraX65 og PyMol (Schrodinger L.L.L.C.).
E. coli GyrB R286K, R286Q og E264A oprensning
Den modificerede pET28b anvendt til wild-type E. coli GyrB-overekspression blev muteret ved site-directed mutagenese ved hjælp af QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis-kittet (Agilent) for at generere tre plasmider, der har R286K-, R286Q- eller E264A-mutationer (Supplerende tabel 4). Overekspression og oprensningsprocedurer for de tre mutanter er identiske med wild-type GyrB beskrevet ovenfor i afsnittet Metoder.
T. thermophilus GyrB K284R, K284Q oprensning
Den modificerede pET28b, der blev anvendt til wild-type T. thermophilus GyrB-overekspression12 blev muteret ved site-directed mutagenese ved hjælp af QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis-kittet (Agilent) for at generere to plasmider, der har K284R- eller K284Q-mutationer (Supplerende tabel 4). Overekspression og oprensningsprocedurer for de to mutanter er identiske med E. coli-wildtypen GyrB, som er beskrevet ovenfor i afsnittet Metoder.
DNA supercoiling assay
En stigende koncentration af DNA-gyrase (GyrA2B2) blev inkuberet ved 37 °C med 6 nM afslappet pUC19 plasmid i en reaktionsblanding, der indeholder 20 mM Tris-acetat pH 7,9, 100 mM kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 100 µg/ml BSA. Efter 30 min. blev reaktionerne stoppet ved tilsætning af SDS 1%. Agarosegelelektroforese blev anvendt til at overvåge omdannelsen af afslappet pUC19 til den superoprullede form. Prøverne blev kørt på en 0,8 % agarose, 1X Tris Borate EDTA buffer (TBE) gel ved 6 V/cm i 180 min. ved stuetemperatur. Agarosegelene blev farvet med 0,5 mg/ml ethidiumbromid i 1X TBE i 15 min, efterfulgt af 5 min destaining i vand. DNA-topoisomerer blev afsløret ved hjælp af en Typhoon (GE Healthcare).
ATPaseaktivitetsassay
ATP-hydrolyse måles ved at følge oxidationen af NADH formidlet af pyruvatkinase (PK) og laktatdehydrogenase (LDH). Absorbansen blev overvåget ved 340 nm over 600 s ved 37 °C med et Shimadzu 1700-spektrofotometer. Reaktionerne blev optaget i tre eksemplarer med 50-100 nM GyrA2B2 og 16 nM lineært DNA (pCR-blunt) i 500 µl af en buffer indeholdende 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM kaliumacetat, 8 mM magnesiumacetat, 7 mM BME, 100 µg/mg BSA, 4U/5U af PK/LDH-blanding, 2 mM PEP og 0.2 mM NADH.
Multiple alignment and evolutionary conservation of residues
GyrB ATPase/Transducer protein sekvenser fra 30 arter (Uniprot codes: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens; Q83FD5_COXBU: Coxiella burnetii; GYRB_ECOLI: Escherichia coli; GYRB_NEIGO: Neisseria gonorrhoeae; GYRB_SALTY: Salmonella typhimurium; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa; Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile; GYRB_RICFE, Rickettsia felis; Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis; GYRB_BORBU; Borrelia burgdorferi; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis; GYRB_THEMA, Thermotoga maritima; GYRB_THET8, Thermus thermophilus; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) blev afstemt ved hjælp af Clustal Omega-serveren (EMBL-EBI). Den efterfølgende tilpasning blev brugt til at plotte den evolutionære bevarelse af aminosyrerne på ATPase/transducer-strukturen (PDB ID 1EI1) ved hjælp af ConSurf-serveren (http://consurf.tau.ac.il). Det fylogenetiske træ blev genereret ved hjælp af neighbour-joining-metoden ved hjælp af den multiple alignment i Clustal Omega.
Rapporteringsresumé
Der findes yderligere oplysninger om forskningsdesign i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.