In vitro antimikrobiel følsomhed af Aerococcus urinae over for 14 antibiotika, og time-kill kurver for penicillin, gentamicin og vancomycin

Abstract

Aerococcus urinae er en nybegynder i klinisk og mikrobiologisk praksis og forårsager urinvejsinfektioner, bakteriæmi/septikæmi og/eller endokarditis. I denne undersøgelse præsenteres for første gang en evaluering af aktiviteten af et repræsentativt panel af antibiotika mod et stort antal A. urinae-isolater. 56 isolater af A. urinae’s modtagelighed in vitro (MIC) over for 14 antibiotika blev bestemt ved agarfortynding. Generelt udviste A. urinae-isolaterne kun ringe variabilitet mellem isolaterne og havde lave MIC’er over for penicillin, amoxicillin, piperacillin, cefepime, vancomycin og rifampicin. Der blev ikke fundet høj aminoglykosidresistens hos nogen af isolaterne. Der blev set moderat til god aktivitet med quinoloner, erythromycin og tetracyclin. Isolater fra to patienter med endokarditis blev undersøgt med time-killkurver for penicillin, gentamicin og vancomycin. Penicillin og vancomycin alene udviste langsom eller ingen bakteriedræbende aktivitet mod de to stammer. Ved kombination af enten penicillin eller vancomycin med gentamicin blev der opnået hurtig bakteriedræbende aktivitet for begge stammer med begge kombinationer. Behandlingsmulighederne for A. urinae synes at omfatte penicilliner i mindre alvorlige tilfælde. I alvorlige tilfælde, dvs. endokarditis, tyder tidsdræbende undersøgelser på en gavnlig effekt af kombinationen med gentamicin. Hos den penicillinallergiske patient udgør vancomycin i kombination med gentamicin det mest oplagte alternativ.

Indledning

I løbet af det seneste årti har den kliniske relevans af forskellige katalase-negative, Gram-positive kokker fået stor opmærksomhed.1 Blandt disse er Aerococcus urinae en nybegynder i klinisk og mikrobiologisk praksis, som først blev rapporteret i 19892 og udpeget i 1992.3A. urinae-isolater blev oprindeligt genkendt på deres cellemorfologi (Staphylococcus-lignende i Gram’s farvning) og vækstkarakteristika (ligner α-hæmolytiske streptokokker på blodagar), en negativ katalasereaktion og et meget konstant antibiogram, der viser følsomhed over for penicillin og resistens over for sulfonamider og aminoglycosider.2-4 I to rapporter er A. urinae-stammer blevet isoleret fra 0,4-0,8 % af de undersøgte urinprøver.2,5 De fleste patienter, hvorfra A. urinae blev isoleret, var ældre med prædisponerende forhold og tegn på urinvejsinfektion.2,4,5 Stammer, der forårsager urinvejsinfektioner, er blevet anerkendt i Danmark, Sverige, Holland, Frankrig, USA, Canada og sydamerikanske lande.6A. urinae er også blevet isoleret fra blod fra patienter med urogen bakteriæmi/septikæmi med eller uden endokarditis.7-11 En landsdækkende undersøgelse i Danmark fra 1987 til 1995 identificerede 26 patienter med A. urinae isoleret fra blod,6 svarende til 0,5 patienter/år/1 million indbyggere og 0,8 % af de infektiøse endokarditisepisoder.8 Bakteriæmiske/septikæmiske episoder reagerede godt på behandling med β-lactamer alene eller i kombination med en aminoglykoside, medmindre bakteriæmien blev kompliceret med endokarditis, i hvilke tilfælde fem ud af seks patienter døde. Hos en patient kunne A. urinae ved obduktionen dyrkes fra klapperne på trods af tilsyneladende relevant antibiotikabehandling. Derfor skal den optimale behandling af endokarditis med A. urinae bestemmes.

Testning af A. urinae-isolater ved hjælp af tablet/disc-diffusionsmetoder har afsløret modtagelighed for en lang række antimikrobielle stoffer, herunder både β-lactam- og ikke-β-lactam-antibiotika.5,6,12 Da A. urinae-isolater primært har været forbundet med urinvejsinfektioner, er det bemærkelsesværdigt, at stammerne er fundet resistente over for sulfonamider og andre antimikrobielle stoffer, der anvendes til behandling af urinvejsinfektioner, herunder co-trimoxazol, trimethoprim, nalidixinsyre og polymyxiner2,5,6,12 . For nylig er modtageligheden af to A. urinae-isolater fra endokarditis-patienter blevet undersøgt ved hjælp af MIC’er for syv antibiotika, og der blev udført time-kill kurver for penicillin i kombination med gentamicin eller netilmicin.11 Den foreliggende undersøgelse karakteriserer yderligere modtagelighedsmønstret for 56 A. urinae-isolater af forskellig geografisk oprindelse. MIC’er for 14 antibiotika blev bestemt, og for to isolater blev der udført time-kill kurveforsøg med penicillin, gentamicin og vancomycin, alene eller i kombination, for at få flere oplysninger om optimale behandlingsregimer for alvorlige infektioner forårsaget af A. urinae.

Materiale og metoder

Stammer

Femzig-seks epidemiologisk ubeslægtede kliniske isolater af A. urinae. urinae blev undersøgt, herunder 42 danske isolater (17 blodisolater og 25 urinisolater) og 14 ikke-danske urinisolater: et fra Nederlandene (venligst stillet til rådighed af P. J. G. M. M. Rietra), fire fra Sverige (venligst stillet til rådighed af E. Falsen, Culture Collection, Göteborg Universitet) og syv nordamerikanske isolater (venligst stillet til rådighed af R. R. Facklam, The Streptococcus Laboratory, CDC, Atlanta, GA, USA). Der blev anvendt følgende referencestammer: Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATTC 25922 og Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Antimikrobielle stoffer

Der blev anvendt følgende antimikrobielle stoffer: Benzylpenicillin (Leo, Ballerup, Danmark); cefepime (Bristol-Myers Squibb, Wallingford, CT, USA); amoxicillin, ceftriaxon, erythromycin, amikacin, gentamicin, netilmicin, rifampicin, vancomycin (Sigma, St Louis, MO, USA); oxytetracyclin (Rosco, Taastrup, Danmark), piperacillin (Lederle, Pearl River, NY, USA), ciprofloxacin (Bayer, Leverkusen, Tyskland), og sparfloxacin (Rhône Poulenc Rorer, Vitry, Frankrig).

MIC-bestemmelse

På grund af den krævende vækst af A. urinae måtte testbetingelserne ændres i forhold til standardanbefalingerne for at kunne foretage MIC-bestemmelser (dvs. 5% blodtilskud til agaren og inkubation i 5% CO2-atmosfære i 48 timer)13-15. MIC’erne blev bestemt ved agarfortyndingsmetoden. To gange serielle fortyndinger af antimikrobielle midler blev fremstillet i Mueller-Hinton agar (Difco Laboratories GmbH, Augsburg, Tyskland) suppleret med 5 % lyseret hesteblod. Antibiotika blev testet fra 0,008 til 512 mg/L, undtagen amoxicillin (0,032-256 mg/L), rifampicin (0,008-32 mg/L) og oxytetracyclin (0,008-2 mg/L). Inokula på 107 cfu/mL (104 cfu/plet) blev fremstillet af agarkulturer fra natten over og suspenderet i 0,9 % NaCl og blev påført med en 21-punkts multipel inokulator (Denley Instruments Ltd, Billinghurst, UK). Resultaterne blev aflæst efter inkubation i 2 dage ved 37°C i 5% CO2. MIC blev aflæst som den laveste koncentration, der viste vækst af højst tre kolonier.

Tid-dødskurveundersøgelser

To af de testede blodisolater (B1 og B8), begge fra patienter med endokarditis, blev undersøgt. Stammerne blev testet mod penicillin (MIC 0,125 og 0,6 mg/L, henholdsvis), gentamicin (MIC 256 og 64 mg/L, henholdsvis) og vancomycin (MIC 0.5 og 1 mg/L) i følgende klinisk opnåelige koncentrationer: penicillin 2 × og 10 × MIC (henholdsvis P2 og P10); vancomycin 4 × og 10 × MIC (henholdsvis V4 og V10); gentamicin 10 mg/L (G10); og kombinationerne penicillin + gentamicin og vancomycin + gentamicin i følgende koncentrationer: henholdsvis P2G10, P10G10, V4G10 og V10G10. Ved t = -1 time blev friske kolonier, der var vokset i løbet af natten, suspenderet til ca. 105 cfu/mL i rør med forvarmet Todd-Hewitt-bouillon. Rørene blev anbragt i et vandbad ved 37 °C. Ved t = 0 h blev antibiotika, der var forberedt umiddelbart før analysen, tilsat til rørene i to eksemplarer. Tre rør uden antibiotika blev anvendt som vækstkontrol. Der blev udtaget prøver i to eksemplarer ved 0, 3, 6 og 24 timer fra hvert rør. Prøverne blev fortyndet serielt og udplottet. Antallet af overlevende kolonier blev talt efter inkubation natten over ved 37 °C i luft i plastikposer sammen med vådt silkepapir . Ved brug af prøver på 20 μL var det mindste antal bakterier, der kunne tælles, 50 cfu/mL. Carry-over-effekten blev elimineret for penicillin-gentamicin-forsøgene ved at tilsætte 100 μL 100 000 U/mL penicillinase til hver plade. For vancomycin-gentamicin-forsøgene blev carry-over-effekten elimineret ved fortynding. En pilotundersøgelse påviste carry-over-effekt i 100-prøven, men ikke i 10-1-prøven, og cfu blev derfor optalt ved hjælp af 200 μL af 10-1-prøverne, hvilket stadig giver en detektionsgrænse på 50 cfu/mL. Alle eksperimenter blev udført mindst to gange på forskellige dage. Bakteriedræbende aktivitet blev defineret som en reduktion af inokulumet med mindst 99,9 % inden for 24 timer. Synergi (S), additiv virkning (A) og antagonisme blev defineret som: >2 log mere dræbende effekt (S), >1 og <2 log mere dræbende effekt (A) og >2 log mindre dræbende effekt for kombinationen sammenlignet med det bedste af de enkelte antibiotika.

Resultater

MIC-bestemmelse

De MIC’er, der er opnået for de 56 isolater, er vist i tabellen. Ved anvendelse af de brudpunkter for streptokokker, der anbefales af NCCLS14,15 eller af den svenske referencegruppe for antibiotika (SRGA)16,17 , var isolaterne modtagelige for penicillinerne, mens der blev fundet nedsat modtagelighed for de testede cefalosporiner. MIC’erne for aminoglykosiderne viste reduceret modtagelighed for næsten alle isolater. Der blev dog ikke fundet høj aminoglykosidresistens (dvs. gentamicin > 1000 mg/L) for nogen af isolaterne. Alle isolater var modtagelige for vancomycin. Rifampicin var det mest aktive testede lægemiddel med en MIC50 på 0,031 mg/L (interval <0,004-0,064 mg/L), bortset fra ét isolat med en MIC > 32 mg/L (gentagne test). Aktiviteterne af quinolonerne ciprofloxacin og sparfloxacin viste sig at være lige gode.

Dræbende kurveundersøgelser

Den gennemsnitlige tidsdræbende kurve for hvert forsøg er vist i figuren. Vancomycin alene (både 4 × og 10 × MIC) udviste bakteriedræbende aktivitet mod stamme B1. For penicillin blev der kun fundet bakteriedræbende aktivitet for 10 × MIC mod B8. For begge antibiotika var den bakteriedræbende virkning langsom, dvs. den viste sig først efter 24 timer. Gentamicin var ikke bakteriedræbende – i de fleste forsøg blev der set vækst. Penicillin i kombination med gentamicin var synergisk og var hurtigt bakteriedræbende for stamme B8 i både P2G10 og P10G10. For stamme B1 blev der imidlertid kun fundet en additiv og langsom bakteriedræbende virkning. Ved kombination af vancomycin og gentamicin blev der fundet en hurtig baktericid virkning for begge stammer. Der kunne påvises en synergieffekt efter 3 timer og 6 timer for stamme B8. Efter 24 timer var vancomycins dræbende aktivitet imidlertid så udtalt, at det ikke var muligt at påvise en synergieffekt. For B1 blev der kun fundet en additiv virkning. Der blev ikke registreret antagonistiske virkninger i nogen af forsøgene.

Diskussion

Denne undersøgelse præsenterer for første gang en evaluering af MIC’erne for et repræsentativt panel af antibiotika mod et stort antal A. urinae-isolater fra patienter med urinvejsinfektion, bakteriæmi/septikæmi og/eller endokarditis. For at evaluere brugen af antibiogrammer til taksonomiske formål er MIC’er for 15 antibiotika for 10 A. urinae-stammer tidligere blevet undersøgt12 , men der er ikke fremlagt detaljerede data.

A. urinae er krævende organismer, der kræver tilsætning af blod i medierne og undertiden inkubation i en CO2-beriget atmosfære og/eller en længere inkubationsperiode for at opnå tilstrækkelig vækst til at teste antibiotikafølsomheden. Derfor kunne stammerne ikke testes ved hjælp af standardbetingelser som beskrevet af BSAC eller NCCLS.13-15 Behovet for at ændre kulturbetingelserne er imidlertid et almindeligt problem for fastiøse Grampositive bakterier.18,19A. urinae isolater udviste et antimikrobielt modtagelighedsmønster svarende til α-hæmo-lytiske streptokokker med kun små variationer i modtagelighed mellem isolaterne. MIC’erne for β-lactamer for isolaterne var typisk inden for fire to gange fortyndingstrin, undtagen for cefalosporinerne ceftriaxon og cefepime, som viste en større variation i MIC (tabel). På grund af den mulige indflydelse af CO2-inkubering (sænkning af pH) bør man være forsigtig ved vurderingen af modtagelighed for tetracyklin (overvurderet modtagelighed) og erythromycin (undervurderet modtagelighed). Blandt de undersøgte A. urinae-isolater blev der ikke konstateret nogen høj grad af resistens over for de testede aminoglykosider, hvilket åbner mulighed for en synergieffekt ved kombination med enten en β-lactam eller vancomycin (vide infra). Ud fra MIC’erne findes der flere behandlingsalternativer til alvorlige infektioner, da isolaterne var modtagelige for penicilliner, vancomycin og rifampicin (undtagen ét isolat). De udvalgte quinoloner, ciprofloxacin og sparfloxacin, udviste også god aktivitet. Selv om det er en kræsen organisme, har de resultater, der er opnået ved hjælp af diskdiffusionsmetoder2,5,20 , været i overensstemmelse med de MIC’er, der er præsenteret i denne undersøgelse, hvilket tyder på, at der kan opnås et pålideligt resultat ved hjælp af disse rutinemæssige modtagelighedsmetoder.

Retningslinjer for behandling af alvorlige infektioner som f.eks. septikæmi med eller uden endokarditis bør optimalt set baseres på klinisk erfaring i omhyggeligt tilrettelagte undersøgelser, men dette er vanskeligt, når der er tale om sjældne bakterier. Derfor kan in vitro-undersøgelser, herunder aflivningskurveteknikker, i disse tilfælde levere vigtige oplysninger til klinikeren.

Antibiotikakoncentrationer, der kan opnås in vivo, blev valgt til eksperimenterne. For gentamicin blev der valgt en dosis på 10 mg/L, hvilket svarer til den koncentration, der opnås ved en gang daglig dosering på 240 mg (svarende til 3-4 mg/kg).21 Selv om flere artikler anbefaler to gange daglig dosering ved endokarditis, er det desuden almindeligt at anvende gentamicin en gang daglig i Danmark på grund af den reducerede nefrotoksicitet og det forhold, at den synergiske effekt med β-lactam-antibiotika øges med stigende aminoglykosidkoncentrationer.22 De data, der blev opnået i vores in vitro-undersøgelse af aflivningskurver for penicillin og vancomycin, viste, at hverken penicillin eller vancomycin var baktericid mod nogen af de to testede isolater fra patienter med infektiøs endokarditis. Ved kombination med gentamicin blev der opnået en baktericid virkning mod begge isolater for både penicillin og vancomycin. Heldigvis anbefales disse regimer til behandling af infektiøs endokarditis af ukendt ætiologi i hele verden.23 De to stammers aflivningsrater var forskellige, hvilket indikerer, at der kan være variationer mellem stammerne. På trods af in vitro-modtagelighed for de givne antibiotika fandt vi, at prognosen var dårlig for ældre patienter med infektiøs endokarditis forårsaget af A. urinae.8 De foreliggende resultater for penicillin, gentamicin og netilmicin (MIC) er i overensstemmelse med resultaterne i den nylige schweiziske rapport af Zbinden et al.11 for to A. urinae-isolater fra endokarditis-patienter.

Behandlingsmulighederne for A. urinae synes at omfatte penicilliner i mindre alvorlige tilfælde. I alvorlige tilfælde, dvs. endokarditis, tyder time-kill-undersøgelserne på en fordel ved at kombinere penicillin eller vancomycin med gentamicin. Hos den penicillinallergiske patient udgør vancomycin det mest oplagte alternativ.

Tabel.

MIC’er for 14 antimikrobielle midler ofr A. urinae (n = 56)

Den øvre grænse for modtagelighed for streptokokker i henhold til NCCLS15 eller efter SRGA16,17 markeret med grå skravering.

aAntal af stammer.

bMIC *< 0,032 mg/L.

cMIC > 32 mg/L.

dMIC > 2 mg/L

Tabel.

MIC’er for 14 antimikrobielle stoffer afr A. urinae (n = 56)

Den øvre grænse for modtagelighed for streptokokker i henhold til NCCLS15 eller efter SRGA16,17 markeret med grå skravering.

aAntal af stammer.

bMIC *< 0,032 mg/L.

cMIC > 32 mg/L.

dMIC > 2 mg/L