Subjekter
Denne undersøgelse omfattede 88 behandlingsnaive LC-patienter uden fjernmetastaser. Alle patienter blev diagnosticeret med larynxpladecellekarcinom ved patologisk undersøgelse af prøver og blev behandlet på Otorhinolaryngologisk afdeling, hoved- og halskirurgi, University of the Ryukyus, mellem januar 2008 og december 2017. Den endelige prognose for patienterne blev bedømt i juli 2018. Klassificering af tumor, knude, metastase (TNM) stadium blev udført i henhold til AJCC Staging Manual (7. udgave). For at bestemme det kliniske stadium og for at opdage samtidige multiple primære kræftformer gennemgik patienterne fysiske og endoskopiske undersøgelser af den øvre mave-tarmkanal, ultralydsinspektion af halsen, computertomografi (CT) og 18F-fluorodeoxyglucose-positronemissionstomografi CT-billeddannelse.
Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board of the University of the Ryukyus og blev udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen fra 1975, som revideret i 2008. Informeret samtykke blev indhentet fra alle LC-patienter før indskrivning.
Behandling
Den primære behandling af den primære læsion med kurativ hensigt var konventionel strålebehandling (RT) alene eller laserresektion i T1, samtidig kemoradioterapi (CCRT) i T2, CCRT eller kirurgi i T3 og kirurgi i T4, uanset tilstedeværelsen af HPV. Nodale læsioner blev behandlet med CCRT eller halsdissektion kombineret med resektion af den primære læsion. Alle patienter, der modtog RT (samlet dosis, 70 Gy), havde CT-assisteret tredimensionel strålebehandlingsplanlægning i behandlingsposition med maskeimmobilisering. Protokollen for CCRT var som tidligere rapporteret . Når den primære tumor i T3 ikke viste et partielt respons uanset halslymfeknuderesponset ved 39,6 Gy bestråling, blev patienterne underkastet kurativ kirurgi for den primære læsion kombineret med halsdissektion.
Detektion af HPV-status og p16-immunohistokemi
Alle vævsprøver fra primære læsioner uden nogen stråle- eller kemoterapi blev analyseret med polymerasekædereaktion (PCR) til HPV-DNA-detektion ved hjælp af friske frosne prøver, som blev opnået ved biopsi eller kirurgisk resektion, og p16-immunohistokemi ved hjælp af FFPE-prøver. Tilfælde med negative HPV-detektionsresultater på PCR og p16-overekspression (≥75 % positive celler og mindst moderat farvningsintensitet) blev yderligere evalueret for HPV-status ved hjælp af in situ-hybridisering (ISH) med HPV-DNA-sonder (DNA ISH) . Kvantitativ realtids-PCR (qPCR) for viral belastning og fysisk status, som beskrevet nedenfor, blev udført i tilfælde, der har HPV-16 .
PCR til HPV DNA-detektion
Kort sagt blev DNA isoleret fra tumorprøverne ved hjælp af et Gentra Puregene Tissue Kit (QIAGEN, Germantown, MD). Tilstedeværelsen og integriteten af DNA blev verificeret i alle prøver ved PCR β-globin-genamplifikation ved hjælp af primerne PC04 og GH20 . De generelle konsensuspræmersæt GP5+/GP6+ og MY09/MY11 blev anvendt til at analysere tilstedeværelsen af HPV-DNA ved PCR (tabel 1) som tidligere beskrevet . Desuden blev DNA-prøver, der var negative for GP5+/GP6+ eller MY09/MY11 PCR, genamplificeret ved hjælp af en nested PCR-metode med GP5+/GP6+-printerparret. PCR-produkter af den forventede størrelse (GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp) blev oprenset og sekventeret direkte med en ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekvenserne blev justeret og sammenlignet ved hjælp af BLAST-programmet med sekvenserne af kendte HPV-typer i GenBank-databasen.
p16-immunohistokemi
Immunohistokemi for p16 blev udført ved hjælp af et CINTec® p16 Histology Kit (MTM Laboratories; Roche Applied Sciences, Penzberg, Tyskland) i henhold til producentens protokol . Immunmærkning blev visualiseret ved inkubation i 3,3′-diaminobenzidin, og de farvede objektglas blev kontrafarvet med hæmatoxylin.
Der blev anvendt følgende scorekriterier for p16-immunoreaktivitet i den foreliggende undersøgelse: 0, ingen farvning; 1, 1 – < 25 % af tumorcellerne positive for p16; 2, 25 – < 50 % positive; 3, 50 – < 75 % positive; 4, ≥75 % positive og svag farvningsintensitet; og 5, ≥75 % positive og mindst moderat farvningsintensitet. Udtrykket “p16-overekspression” (p16-positiv) blev defineret som en score på 5 i denne undersøgelse.
ISH med HPV DNA-sonder
Biotinyltyramidbaseret ISH blev udført ved hjælp af GenPoint™ HPV biotinyleret DNA-sonde og GenPoint tyramid-signalforstærkningssystemet til biotinylerede prober i henhold til producentens protokol (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). GenPoint HPV-biotinyleret DNA-sonde reagerer med HPV-typerne 16, 18, 31, 33, 33, 35, 39, 39, 45, 45, 51, 51, 52, 56, 58, 59 og 68 i 4 μm tykke snit af FFPE-prøver. Detektion af den hybridiserede sonde blev udført ved hjælp af GenPoint-detektionssystemet i henhold til producentens protokol med den medfølgende primære streptavidin-horseradishperoxidase (HRP), biotinyltyramid, sekundær streptavidin-HRP og 3,3′-diaminobenzidin l (Dako; Agilent Technologies). Dias blev modfarvet med hæmatoxylin.
Evaluering af viral belastning og fysisk status af HPV-16 ved qPCR
For at evaluere viral belastning og fysisk status af HPV-16 blev qPCR udført som tidligere beskrevet . Kort fortalt blev der anvendt primere og TaqMan-prober, der var rettet mod HPV-16 E2- og E6-åbne læserammer (tabel 1). Primerne og proberne genkender E2-hinge-regionen, som slettes ved HPV-16-integration. Der blev skabt to standardkurver for E2- og E6-generne ved amplifikation af 10-foldige serielle fortyndinger (101, 102, 103, 104, 105 og 106 virale kopier) af pB-actin early plasmidet, som var en gave fra Karl Munger, og som bærer den komplette HPV-16 early genregion (Addgene plasmid # 13711; Addgene, Cambridge, MA). Den virale DNA-belastning blev vurderet ved at beregne E6-kopienummeret. Der blev udarbejdet en ekstern standardkurve ved hjælp af kendte serielle fortyndinger (0,3, 3, 30 og 300 ng) af humant genomisk placenta-DNA (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) til kvantificering af cellulært DNA, og β-globin blev forstærket som tidligere beskrevet. Mængden af DNA blev beregnet ved at plotte Cq-værdierne mod logaritmen af standardkurven. Den fysiske status for HPV-16 blev vurderet på grundlag af en tidligere offentliggjort metode . Et E2/E6-forhold ≥ 1 indikerer, at den episomale form er fremherskende, mens et forhold mellem E2-kopiantal/total E6 < 1 indikerer tilstedeværelsen af både integrerede og episomale former (blandet form).
Detektion af E6 mRNA-ekspression ved qPCR og RNA ISH hos HPV-16-positive patienter med p16-overekspression
E6 mRNA-ekspression blev påvist i prøver fra patienter, der blev identificeret som HPV-16-positive med p16-overekspression. Samlet RNA blev ekstraheret fra frosne væv ved hjælp af RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Japan) i henhold til producentens anvisninger. Samlet RNA (500 ng) blev anvendt til at syntetisere første streng cDNA ved hjælp af et PrimeScript™ RT Reagent Kit med gDNA Eraser (Perfect Real Time; Takara Bio) i henhold til producentens anvisninger. Til måling af HPV-16 E6 mRNA-ekspression blev der udført qPCR ved hjælp af CFX96 Touch™ Real-Time PCR-detektionssystemet CFX96 Touch™ (Bio-Rad, Hercules, CA) og TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Der blev anvendt primere og TaqMan-sonder (tabel 1), der er rettet mod HPV-16 E6-genet og β-actin-genet . β-actin-sonden blev mærket med FAM i 5′-enden og med TAMRA i 3′-enden (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan). Amplifikationsbetingelserne var: 2 min ved 50 °C, 10 min ved 95 °C og en 2-trinscyklus ved 95 °C i 15 s og 60 °C i 60 s i i alt 40 cyklusser. Der blev genereret to standardkurver for E6- og β-actin-generne ved amplifikation af serielle 10-dobbelte fortyndinger (101, 102, 103, 104, 105 og 106 kopier) af pB-actin early plasmidet og pCAG-mGFP-actin plasmidet, som var en gave fra Ryohei Yasuda, og som bærer den komplette kodningsregion for β-actin (Addgene plasmid # 21948; Addgene). Ekspressionen af E6-genet i hver prøve blev normaliseret med mængden af den interne kontrol β-actin.
RNA ISH for HPV-16/- 18 E6/E7 mRNA blev udført ved hjælp af et RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt blev serielle 4 μm tykke sektioner af FFPE-prøver deparaffiniseret i xylen og rehydreret ved hjælp af en gradueret alkoholserie. Endogen peroxidase blev blokeret med RNAscope® Hydrogen Peroxide Reagent ved stuetemperatur i 10 minutter. Target HPV RNA-retrieval blev udført i RNAscope® Target Retrieval Reagent ved 100 °C i 15 min. Prøverne blev fordøjet med RNAscope® Protease Plus ved 40 °C i 30 min. HPV-16/- 18 E6/E7 RNA-sonden (RNAscope® Probe-HPV16/18) blev tilsat til sektionerne, og der blev påført et dækglas. Objektsglassene blev overført til et befugtet kammer til hybridisering ved 40 °C i 2 timer. Dernæst blev dækglassene fjernet, og objektsglassene blev vasket med RNAscope® Wash Buffer Reagent ved 40 °C. Signalforstærkning blev udført i henhold til producentens anvisninger. Detektion af den hybridiserede sonde blev udført ved hjælp af 3,3′-diaminobenzidin (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit). Prøverne blev kontrafarvet med hæmatoxylin. Positive kontrolglas (HeLa-celler, der udtrykker HPV-18 E6/E7 mRNA) blev inkluderet i RNA ISH. Positiv farvning blev identificeret som brune punktformede prikker set i kernen og/eller cytoplasmaet.
Statistisk analyse
Pearson’s chi-square test blev anvendt til at sammenligne LC-patienternes karakteristika i henhold til HPV DNA- og p16-overekspressionsstatus. Den kumulative overlevelse (CS) blev beregnet ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og blev sammenlignet mellem to grupper ved hjælp af log-rank-testen. Alle analyser blev udført med SPSS Statistical Package (SPSS, version 25.0; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). P < 0,05 blev betragtet som signifikant.