APL har tilbudt native gelanalyser siden 1998. I dag ignorerer mange laboratorier desværre dette værdifulde værktøj, fordi de tror, at native geler bare er for svære at bruge, eller fordi de fejlagtigt tror, at de kun kan bruges med sure proteiner. Hos Alliance Protein Laboratories kører vi rutinemæssigt native geler på både basiske og sure proteiner. Vi vil med glæde køre prøver for dig og/eller samarbejde med dig om at udvikle en protokol til brug i dit laboratorium.
Hvad er en native gel?
“Native” eller “ikke-denaturerende” gelelektroforese køres i fravær af SDS. Mens proteiners elektroforetiske mobilitet i SDS-PAGE primært afhænger af deres molekylmasse, afhænger mobiliteten i native PAGE både af proteinets ladning og dets hydrodynamiske størrelse.
Den elektriske ladning, der driver elektroforese, er styret af proteinets iboende ladning ved pH-værdien af den kørende buffer. Denne ladning vil naturligvis afhænge af proteinets aminosyresammensætning samt af posttranslationelle modifikationer såsom tilføjelse af sialinsyrer.
Da proteinet bevarer sin foldede konformation, vil dets hydrodynamiske størrelse og mobilitet på gelen også variere med arten af denne konformation (højere mobilitet for mere kompakte konformationer, lavere for større strukturer som oligomerer). Hvis native PAGE udføres nær neutral pH for at undgå sur eller basisk denaturering, kan den bruges til at studere konformation, selvassociation eller aggregation og binding af andre proteiner eller forbindelser.
Dermed kan native geler være følsomme over for enhver proces, der ændrer enten et proteins ladning eller konformation. Det gør dem til fremragende redskaber til at påvise ting som:
-
ændringer i ladningen som følge af kemisk nedbrydning (f.eks. deamidering)
-
ufoldet, “smeltet globule” eller andre modificerede konformationer
-
oligomerer og aggregater (både kovalente og ikke-kovalente)
-
bindingsbegivenheder (protein-protein eller protein-ligand)
Disse egenskaber, og deres relativt høje gennemløb gør native geler til fremragende værktøjer til analyse af prøver med accelereret stabilitet, til påvisning af sammenlignelighed af forskellige partier eller processer eller til undersøgelse af virkningerne af hjælpestoffer.
En anden fordel ved native geler er, at det er muligt at genvinde proteiner i deres native tilstand efter separationen. Det kan dog være nødvendigt at genvinde aktive biologiske materialer før en eventuel fiksering eller farvning.
Bemærk, at de native geler, der diskuteres her, nu undertiden kaldes “klare native” geler. De adskiller sig i princippet fra de såkaldte “blå native” geler, som er afhængige af bindingen af farvestof for at give proteinet en meget høj elektrisk ladning, der overvinder den iboende ladning på polypeptidet. Hvis det antages, at mængden af bundet farvestof er proportional med proteinets masse, kan den mobilitet, der observeres ved hjælp af denne “blue native”-protokol, anvendes til at estimere den molare masse ved at sammenligne med proteinstandarder, ligesom det gøres for SDS-PAGE. De massestandarder, der sælges til brug med blå native geler, kan ikke anvendes til at estimere molarmassen for de ægte native geler, der diskuteres her.