Opmærksomheden på, at immunoneutralisering af somatostatin øgede basalvolumen og amylaseproduktion i en isoleret rottepancreas-model, tyder på en intrapancreatisk kilde til somatostatin. Dette pancreatiske somatostatin kunne derfor forårsage en tonisk hæmning af den exokrine pancreatiske sekretion (97). Hos bevidste rotter med galde- og pancreassekretion returneret til tarmen hæmmer iv somatostatin (5 µg kg-1 h-1) basal pancreatisk protein- og væskesekretion med henholdsvis 84 og 64 %; tilsætning af atropin ip (500 µg kg-1 h-1) forårsagede ikke yderligere hæmning (51). Hos bedøvede rotter blev basal sekretion af amylase signifikant hæmmet af en infusion af somatostatin i en relativt høj dosis på 100 µg 100 g-1 h-1. Når det blev givet som en bolusinjektion på 50 µg 100 g-1 BW, steg amylasefrigivelsen imidlertid firedobbelt i 20 min (39). I en tidligere undersøgelse (25) resulterede somatostatin givet i doser på 0,4 til 25 µg kg-1 h-1 til bevidste fistelrotter i dosisafhængige fald i basal flow, bicarbonat- og proteinfrigivelse. Ved de højeste doser blev proteinudledningen reduceret med 80 %, bikarbonat med 63 % og flowet med 42 %. Hos urethanbedøvede rotter blev der observeret en indledende stigning i alle pancreatiske parametre i de første to minutter, efterfulgt af et fald på 30-40 % i proteinudledningen. Under sådanne forhold skulle somatostatin nå op på en dosis på 100 µg kg-1 h-1 for at påvirke den basale bikarbonatfrigivelse. Disse data om basal pancreatisk sekretion af væske og proteiner viser, at den hæmmende virkning af somatostatin synes at være artsspecifik og følsom over for anæstesi, som tidligere vist (17). Når rotter blev infunderet intraduodenalt med SS-14 i doser fra 12 til 96 µg kg-1 h-1, blev den basale samlede volumen- og proteinudskillelse ikke påvirket; disse resultater kunne tyde på, at luminal duodenal somatostatin ikke påvirker den basale pancreassekretion direkte eller gennem basal frigivelse af CCK og sekretin (126). I modsætning til hos rotter hæmmer iv-infusion af SS-28 på 400 ng kg-1 h-1 fuldstændig basal væske- og proteinsekretion hos den bevidste hund (147). Også hos hunde, der var forberedt med mave- og pancreasfistler, hæmmede somatostatin-14 på 2,5 µg kg-1 h-1 basal volumen- og proteinudskillelse med mere end 90 % (146).
Hos mennesker blev pancreatisk stimulering ved intraduodenal indgift af tryptofan eller en blanding af aminosyrer svækket af eksogen SS-28 (58). I andre undersøgelser hos mennesker hæmmede oktreotid postprandial pancreatisk enzymsekretion (81). Hos hunden forårsagede SS-14 givet som iv bolus på 3,5 µg kg-1 efterfulgt af infusion på 3,5 µg kg-1 h-1 signifikante reduktioner af de duodenale aktiviteter af trypsin og amylase under en testmåltidsstimulering (70). Hos rotte hæmmer octreotid signifikant pancreasvolumen, bikarbonat, amylase og serumniveauer af sekretin og CCK som respons på intraduodenal oliesyre, en CCK-frigiver (137).
I raske frivillige (30) blev ren pancreassaft fremstillet ved endoskopisk kanulation af hovedpancreasgangene. Som reaktion på syntetisk sekretin (0,06 CU kg-1 h-1) nåede bikarbonatkoncentrationen i pancreassaft op på 117 µEq ml-1 efter 10 min og en saftstrøm på 7,3 ml/5 min efter 15 min sekretininfusion. SS-14 førte til et fald på 47 % i pancreatisk flowhastighed efter 10 min og på 67 % efter 15 min. Bikarbonat- og proteinkoncentrationerne i pancreassaft viste kun en tendens til at falde ved somatostatindosis på 5 µg kg-1 h-1. Også hos mennesker blev pancreatisk enzymsekretion, men ikke bicarbonatsekretion, stimuleret af secretin (250 ng kg-1/20 min) og caerulein (25 ng kg-1/20 min) hæmmet af SMS 201-995 på en dosisuafhængig måde (73). Hos bevidste hunde (147) blev sekretion af væske og bikarbonat stimuleret af sekretin (1 CU kg-1 h-1) svagt påvirket af større doser af SS-28 (400 ng kg-1 h-1). Ved samme dosis blev proteinproduktion stimuleret af caerulein hæmmet signifikant. Hos bedøvede rotter forårsagede lineært somatostatin-14 givet med 100 µg/100 g-1 h-1 en stærk hæmning af pancreatisk amylase- og trypsinfrigivelse stimuleret af 3 IVY-hundeenheder/100 g-1 h-1 CCK med en hurtig genopblussen af disse sekretioner, når somatostatininfusionen blev afsluttet (39). Hos bevidste rotter med omledning af pancreassaft (51), som forårsagede kraftige stigninger i protein- og væskesekretionerne, hindrede alle fem doser af infunderet octreotid (5,20,80,320 og 1280 ng kg-1 h-1) signifikant både protein- og væskesekretion med IC50 på henholdsvis 40 og 60 ng kg-1 h-1. Den maksimale hæmning af protein og væske nåede op på henholdsvis 90 % og 75 % ved en dosis på 1,28 µg kg-1 h-1. SS-14 havde sammenlignet med dets analog oktreotid en IC50 på 0,7 µg kg-1 h-1 for proteinsekretion og 1,2 µg kg-1 h-1 for væskesekretion, med en maksimal hæmmende virkning opnået ved 25 µg kg-1 h-1 for både protein- og væskesekretion. Disse data indikerer, at octreotid er 20 gange mere potent end SS-14 til at hæmme pancreatisk protein- og volumensekretion stimuleret af pancreasjuiceafledning.
In vitro-undersøgelser
Pancreatisk enzym- og væskesekretion in vivo er summen af talrige komplekse fysiologiske processer, der omfatter samspillet mellem endokrine og parakrine hormoner samt stimulering og frigivelse af neurotransmittere. På grund af disse mange interaktioner er det ofte vanskeligt at vurdere, om et stof, der hæmmer pancreassekretion in vivo, påvirker acinær- og duktalcellefunktioner direkte eller ændrer frigivelsen af sekretagoger. Derfor kan den isolerede perfunderede bugspytkirtel, de isolerede acinære og duktale cellepræparater og cellekulturer af begge celletyper give svar på nogle af disse spørgsmål.
Rats pancreatiske acinære celler besidder receptorer, der er specifikke for somatostatin-14 og 28 (124,166), som forbliver til stede efter cellepræparaterne (40). Det er også blevet rapporteret, at i den isolerede perfunderede hundepancreas kan kirtlen optage op til 50-80% af det perfunderede somatostatin over et koncentrationsområde på 20 til 4000 pg ml-1 sammenlignet med mindre end 21% af insulin eller glukagon (71). Denne observation blev senere bekræftet med en ekstraktion af SS-14 fra in situ hundepancreas på gennemsnitligt mere end 50 % sammenlignet med mindre end 17 % for glukagon (152). Alle disse observationer lader os tro, at somatostatin bør være i stand til at hæmme direkte neuralt eller hormonelt stimuleret pancreatisk enzymudskillelse in vitro ved hjælp af de ovenfor nævnte cellepræparater.
Trods mange undersøgelser er den hæmmende virkning af SS-14 og SS-28 på stimuleret enzymfrigivelse fra isolerede pancreasacini stadig kontroversiel. For at forstå nogle af disse modsatrettede resultater kan det være nyttigt at skelne mellem effekten af SS på stimulering, hvor agonisten såsom VIP virker gennem cAMP, hvor SS hæmmer, og agonister såsom CCK, hvor nogle forskere observerede en hæmmende effekt og andre ikke. I perfunderede acini fra marsvin blev den kinetiske profil af amylasefrigivelsen som reaktion på VIP signifikant nedsat af SS (100 nM) (140). På den anden side hæmmer octreotid (100 nM) signifikant den synergistiske amylasefrigivelse stimuleret af sekretin + CCK-8 eller af VIP + CCK-8 (65). Somatostatin hæmmer også virkningen af cAMP på calciuminduceret amylaseudskillelse fra rottepancreasacini ved at forskyde dosis-respons-kurven til højre (99), hvilket er endnu et eksempel på, at SS virker gennem cAMP-vejen.
Mange andre undersøgelser viser imidlertid klart, at somatostatin ikke har nogen hæmmende virkninger på den exokrine pancreas in vitro, hvad enten det er på den isolerede perfunderede pancreas, de isolerede acini eller de isolerede lobulepræparater, hvor CCK var stimulus (65,96,99,139,158). I isoleret rottepancreas (43) potenserede eksogent insulin (10 mU ml-1) signifikant CCK- og carbacholstimuleret amylase-sekretion, en potensering, der blev signifikant hæmmet af SS. Manglen på en direkte hæmmende virkning af SS blev også observeret i isolerede parietalceller fra hunde (106). SS på 1 µM kunne nemlig ikke hæmme det gastriske sekretoriske respons på histamin, methacholin og pentagastrin, hvilket understøtter nogle af de ovennævnte data. Interessant nok var SS-28 i den høje koncentration på 10 µM i stand til at stimulere amylasefrigivelsen fra pancreasacini fra marsvin til ca. 68 % af den stimulering, der blev stimuleret af 100 pM caerulein. Et maksimalt sekretorisk respons, der var identisk med det, der blev udløst af caerulein, blev også opnået med to SS-28-analoger, Nat S1-28 og SS28. Under disse betingelser havde SS-14 ingen stimulerende virkning (33). Som forklaring på denne sekretoriske virkning af SS-28 på acini blev det foreslået, at SS-28 kan interagere med CCK-receptoren ved høje koncentrationer (34), en virkning, der hæmmes af DBcGMP, en CCK-receptorantagonist (105). På den anden side kan SS-14’s manglende evne til at hæmme stimuleret enzymudskillelse fra isolerede acini skyldes frigivelse i inkubationsmediet af en aktiv protease, der først blev observeret i den udskilt pancreassaft, og som er i stand til at nedbryde SS-14 (127). Denne serinprotease blev oprenset til homogenitet fra ren pancreassaft fra rotter. Med en MW på ca. 29 kDa svarer den til rottepancreatisk elastase II. Derfor ville det, hvis det blev udskilt i inkubationsmediet, nedbryde SS-14 og forhindre enhver af dets hæmmende virkninger og dermed delvis forklare, hvorfor SS-14 ikke kunne vise sine hæmmende virkninger på enzymfrigivelse in vitro (151). Det kan også påvirke det sekretoriske respons på SS-28 ved lavere koncentrationer i inkubationsmediet. En anden mulighed kunne være, at cellekalciummobiliserende midler nedsætter affiniteten af acinærcellers somatostatinreceptorer for somatostatin (33).
Virkninger på vækst
Normal vækst i en organisme resulterer i en kompleks balance mellem de involverede hormoner, såsom væksthormon, insulin og skjoldbruskkirtelhormoner. Da somatostatin kan hæmme frigivelsen af mange hormoner, skulle dets neutralisering stimulere deres udskillelse og dermed øge væksten. Denne fremgangsmåde med auto-immunisering mod somatostatin for at stimulere væksten er blevet afprøvet på lamme. Når der blev opnået betydelige antistoftitre, var vægtøgningen større hos SS-immuniserede dyr og ledsaget af øget højde. Hos disse immuniserede lam var der et større væksthormonrespons på argininstimulering samt basalt højere blodniveauer af somatomedin (143). Disse data blev senere også bekræftet hos denne dyreart (75). Når det blev givet til rotter, der var implanteret subkutant med en Alzet-minipumpe, havde somatostatin, der blev givet med 1,5 µg h-1 i 14 dage, ingen virkning på deres vægtøgning. Infusion af en somatostatinantagonist førte imidlertid til en signifikant stigning i vægtøgningen i forhold til kontrol (144).
Hos rotte havde daglig injektion af somatostatin-14 på 390 µg kg-1 dag-1 i gelatine i tre uger ingen virkning på kropsvægten, men sænkede parietal- og pepticcelletætheden pr. kubikmillimeter sammenlignet med kontrol. Det modvirkede imidlertid den vækstfremmende virkning af eksogen (130 µg kg-1 dag-1) og endogen gastrinfrigivelse efter transposition af antrum på colon, hvilket forårsagede hypergastrinæmi. Hos disse antrum-transporterede dyr blev den øgede pancreatiske vægt reduceret signifikant med somatostatin (400 µg kg-1 dag-1) i 3 uger (80). I løbet af en 5-dages periode forårsagede somatostatin-14 s.c. i gelatine i doser på 11, 33 eller 100 µg kg-1 hver 8. time signifikante fald i pancreatiske amylase-, chymotrypsin- og proteinkoncentrationer og det samlede DNA-indhold kun ved de to højeste doser uden nogen effekt på den samlede pancreatiske vægt. Imidlertid blev hastigheden af protein-, RNA- og DNA-syntese reduceret signifikant umiddelbart efter hver somatostatininjektion over 24 timer (92). Somatostatin-14, der også blev givet s.c. i gelatine i en dosis på 600 µg kg-1, tre gange om dagen i 2 og 4 dage, reducerede signifikant de trofiske virkninger af caerulein (1 µg kg-1, tre gange om dagen) med en stærk effekt på det samlede DNA-indhold. Interessant nok øgede immunoneutralisering mod SS-14 alle undersøgte vækstparametre signifikant over dem, der blev observeret som reaktion på caerulein (93). Lignende hæmmende virkninger blev observeret ved langvarig indgift af langtidsvirkende somatostatin, SMS 201-995 (54). Omledning af bugspytkirtelsaft hos rotte forårsager betydelige frigørelser af endogent CCK, hvilket resulterer i øget pancreasvækst (89). Ved hjælp af denne procedure med afledning af galde-pancreasjuice førte en sådan teknik anvendt 8 timer dag-1 i 4 dage til betydelige stigninger i pancreasvægt og serum CCK; begge virkninger blev signifikant reduceret af SMS 201-995 infunderet i en dosis på 5 µg kg-1 h-1 og af L-364,718, en CCK-1-receptorantagonist, givet i en dosis på 0,5 mg kg-1 h-1. Under disse betingelser var både SMS og L-364,718 lige effektive til at reducere pancreasvæksten, mens SMS var den eneste antagonist, der var i stand til at reducere endogent CCK frigjort ved pancreas-galdeafledning til et basalt niveau (119). Disse data tyder på, at somatostatin og analoger kan reducere pancreasvækst, der stimuleres af eksogent og endogent frigivet CCK. Endelig blev det observeret, at somatostatin (SMS), der blev infunderet med en hastighed på 5 µg kg-1 h-1 i 2 dage, var i stand til helt at forhindre 70 % kaseininducerede stigninger i pancreasvægt og det samlede RNA- og DNA-indhold (94). Dette er endnu et bevis på, at somatostatin kan kontrollere den inducerede pancreasvækst, der stimuleres af endogent CCK frigivet af en proteinrig kost (50). Givet alene som iv-infusion i 7 dage i en dosis på 5 µg kg-1 h-1 forårsagede SMS 201-995 betydelige reduktioner i pancreas- og tarmvægtene ledsaget af fald i det samlede DNA og RNA i begge organer. Plasma CCK og IGF-1 blev reduceret, mens det samlede pancreatiske IGF-1-indhold blev øget (120). Ud over endogent CCK tyder nogle observationer på, at IGF-1 muligvis er involveret i processen med positiv vækstkontrol i tarmen og bugspytkirtlen. Denne vækstfaktor er nemlig til stede i tarmen (28) og bugspytkirtlen (56), og der er dokumenteret specifikke receptorer på celler i disse organer (76,162); der er blevet postuleret parakrine eller autokrine virkningsmekanismer (29). Somatostatin kan virke på kontrollen af disse to organer gennem en hæmning af IGF-1-frigivelse ledsaget af en lignende virkning på intestinal CCK.
Virkninger af somatostatin på pancreastumorer
Somatostatin er blevet karakteriseret som “den universelle slukknap”, fordi det hæmmer de fleste af de organ- og cellefunktioner, som det er blevet associeret med. En rolle for somatostatin og dets analoger i behandlinger af bugspytkirtelkræft er blevet foreslået, fordi disse molekyler oprindeligt gav positiv ikke-toksisk adjuverende terapi.
I den gyldne syriske hamster, der blev implanteret subkutant med WD-duktale pancreatiske adenocarcinomceller, mindskede en 21-dages kronisk behandling med somatostatinanalogen (L-5-Br-Trp8)SS i en dosis på 20 µg b.i.d. tumorvægten med 44 % og tumorvolumenet med 22 % (114). Somatostatin og dets analog RC-160 har også vist sig at hæmme preneoplastiske forandringer og mindske forekomsten af tumorer hos hamstere, der blev udsat for pancreaskarcinogenet BOP; disse behandlinger forårsagede en stigning i antallet af apoptotiske tumorceller (150). I en anden undersøgelse steg antallet af somatostatinreceptorer på tumorcellerne efter RC-160-behandling (35). Væksten af MIAPaCa-2-celler, der blev implanteret s.c. i nøgenmus, blev dosisafhængigt hæmmet af to daglige injektioner af octreotid på 250 og 2500 µg kg-1 (160). Ved hjælp af en anden form for lægemiddeltilførsel, mikrokapsler, hæmmer RC-160, der leveres med 1250 µg kg-1 d-1 d-1, signifikant væksten af MIAPaCa-2-tumorer i nøgenmus (110). Hvis somatostatin eller dets analoger ikke formår at hæmme tumorvækst, kan det skyldes fraværet af SS-receptor som vist i de humane bugspytkirtelkræftceller PGER, som ikke reagerer på SMS 201-995 (141). I MIAPaCa-2- og PANC-1-celler dyrket i DMEM indeholdende 10 % føtal kalveserum hæmmer 1 µM SS-14 og SMS 201-995 væksten af PANC-1-cellerne med aktivering af tyrosinphosphatasen SHP-1. Tværtimod forårsagede SS og dets analogt vækst af MIAPaCa-2-cellen, og denne vækstvirkning kan skyldes fraværet af SHP-1 i disse celler (31). I celler, der reagerer på somatostatin, er det tidligere blevet vist, at SHP-1 co-purificeres sammen med somatostatinreceptoren (167). En lignende vækststimulerende virkning af SMS blev observeret i BON-celler (humane pankreaskarcinoidceller) ved doser på 1 nM og 100 nM; denne væksteffekt blev ledsaget af betydelige reduktioner i cellernes cAMP-indhold uden at påvirke PI-hydrolysen (66).
De fleste kliniske forsøg med somatostatinanaloger i adjuverende behandling af pankreaskræft har ikke vist respons. Der blev ikke observeret nogen antitumoreffekt hos 14 patienter med metastatisk pancreascancer med tre daglige s.c. injektioner af 100-200 µg SMS i 7 uger (72). I en anden undersøgelse fik 19 patienter med fremskreden exokrin pancreascarcinom somatostatinanalog BIM23014 fra 250 µg til 1 mg dag-1 i 2 måneder. I denne gruppe havde en patient et delvist respons, 6 havde stabile sygdomme, og 11 havde progressiv sygdom (20). Ud fra undersøgelser udført på forskellige bugspytkirtelkræftceller og de forskellige responser, der er opnået på deres vækst, ser det ud til, at en nøgle til succes i den kritiske kamp mod bugspytkirtelkræft er ekspression af specifikke somatostatinreceptorer og anvendelse af den specifikke analog (37). Egenskaberne for de fem klonede undertyper af humane somatostatinreceptorer og de etablerede, sandsynlige og uetablerede indikationer for anvendelse af somatostatinanaloger er blevet opsummeret i reference 77.
Klinisk anvendelse af somatostatin
Klinisk er octreotid blevet anvendt til behandling af akut pancreatitis, men der blev ikke bekræftet nogen enstemmig fordel. I et forsøg (111) blev somatostatin givet i en initial bolusdosis på 250 µg efterfulgt af 250 µg h-1 som en kontinuerlig infusion; behandlingen hos 9 ud af 12 patienter med akut pancreatitis vendte amylasæmi og medførte klinisk forbedring, men viste ikke nogen reduktion i mortalitetsraten. Somatostatin er dog fortsat en effektiv behandling af etablerede lokale komplikationer ved akut pancreatitis, såsom pancreatiske fistler og pseudocyster (112). I en undersøgelse blev patienter med metastaserede endokrine pancreas-tumorer indledningsvis behandlet med 50 µg s.c. octreotid hver 12. time, og senere (6-16 måneder) blev dosis øget til 500 µg hver 8. time. Nogle patienter reagerede ikke på behandlingen, mens den var effektiv hos andre; symptomerne blev bedre, men til sidst kom de tilbage, og alle patienter døde, da resistensfasen af deres sygdom var nået (163). Disse data tyder på, at somatostatin ikke er den ideelle behandling af pancreatitis, men at det kan være nyttigt til behandling af lokale komplikationer af sygdommen. SMS har imidlertid vist sig at være meget effektiv til at eliminere pancreatisk diarré og muliggøre korrektion af dehydrering og acidose. Dens virkning resulterede i en markant reduktion af plasmakoncentrationerne af VIP (84).
3. Værktøjer til undersøgelse af somatostatin
a) Peptid
Somatostatin-14 og -28 er kommercielt tilgængelige. Den vigtigste agonist, der anvendes in vivo, er oktreotid (SMS 201-995), og de øvrige er: RC-160, BIM-23014, BIM-23056, BIM-23027 og L-362,855. Blandt BIM-serien virker BIM-23056 som en agonist på SST-3-receptoren og som en antagonist på SST-5-receptoren (161). De kemiske strukturer for disse molekyler er vist i tabel 1.
b) Antistoffer og assays
Antistoffer mod somatostatin -14, -28, SMS 201-995 og RC-160 er blevet udviklet i mange laboratorier. Guillemin har f.eks. opstillet en RIA ved hjælp af et fåreserum BARBAR-78; dette antiserum er opdrættet mod syntetisk SS-14, og det krydsreagerer med syntetisk SS-28 fra får i et ækvimolært forhold (15). Der blev også udviklet et specifikt antiserum mod SS-28 (67), og der er også etableret RIA’er for SMS 201-995 (5) og RC-160 (83).
c) Eksperimentelle modeller
De fleste af de fysiologiske undersøgelser, der er udført på mennesker, blev udført på mandlige og kvindelige raske frivillige personer (30). Blandt forsøgsdyrene blev undersøgelser oftest udført på bevidste hunde med mave- og bugspytkirtelfistler (146,147), på bevidste rotter med galde-pankreassaft afledt (25,127) og på bedøvede rotter (39). For kronisk virkning af somatostatin på pancreas blev rotter behandlet dagligt med s.c. injektioner af somatostatin (92). In vitro-undersøgelser blev normalt udført med friskpræparerede pancreasacini, isolerede lobuli eller isoleret perfunderet pancreas fra rotte, mus eller marsvin (65, 96,139,158). I tabel 2 er der anført nogle data om anvendte dyrearter, doser eller koncentrationer af somatostatin og analoger, der er givet, og virkninger.