KOMMENTAR
Farveeksklusion er en enkel og hurtig teknik til måling af cellers levedygtighed, men den er underlagt det problem, at levedygtigheden bestemmes indirekte ud fra cellens membranintegritet. Det er således muligt, at en celles levedygtighed kan være blevet kompromitteret (målt ved evnen til at vokse eller fungere), selv om dens membranintegritet (i det mindste forbigående) er bevaret. Omvendt kan cellens membranintegritet være unormal, men cellen kan alligevel være i stand til at reparere sig selv og blive fuldt levedygtig. Et andet potentielt problem er, at fordi farvestofoptagelsen vurderes subjektivt, kan små mængder af farvestofoptagelse, der indikerer en celleskade, gå ubemærket hen. I denne henseende resulterer udelukkelse af farvestoffer udført med et fluorescerende farvestof ved hjælp af et fluorescensmikroskop rutinemæssigt i scoring af flere ikke-levedygtige celler med farvestofoptagelse end test udført med trypanblå ved hjælp af et transmissionsmikroskop.
En mere sofistikeret metode til måling af cellers levedygtighed er at bestemme udelukkelse af farvestoffer ved flowcytometri. Dette kan gøres ved hjælp af typanblåt, da dette protein binder sig til proteiner og derefter udsender et fluorescenssignal, der kan detekteres i et flowcytometer (ved 660 nm, når det er bundet til bovin serumalbumin) (se reference 2 for nærmere oplysninger om anvendelse af trypanblåt i flowcytometri). Alternativt kan udelukkelse måles med andre lysemitterende farvestoffer som f.eks. propidiumjodid (se enhed 5.4 for en beskrivelse af anvendelsen af propridiumjodid til evaluering af cellers levedygtighed ved flowcytometrisk analyse). En detaljeret sammenligning af estimater af levende vs. døde celler ved hjælp af trypanblå udelukkelse vurderet manuelt som beskrevet her og elektronisk vurderet ved flowcytometri viser, at de to teknikker giver meget ensartede resultater i erfarne hænder. Mens den beskrevne teknik med udelukkelse af farvestof er mere tilbøjelig til at føre til fejl på grund af operatørens subjektivitet, er den flowcytometriske metode mindre velegnet til vurdering af cellers levedygtighed under udførelsen af komplekse og tidskrævende celleoprensningsteknikker. En flowcytometrisk teknik er således kun anvendelig, når der skal opnås præcise målinger af antallet af døde celler i en celleblanding.
For nylig er der rapporteret om en “automatiseret fluorescensmikroskopisk levedygtighedstest”, hvor celleviabilitet ved hjælp af propidiumjodid i forbindelse med en anordning, der tæller levende og døde celler i en bærbar mikroskopisk celletæller udstyret med en mikrochip, er blevet rapporteret. Denne tæller skulle være i stand til at vurdere cellernes levedygtighed hurtigere end enten den manuelle teknik, der er beskrevet her, eller flowcytometeret og til at opnå mere præcise og pålidelige tællinger. Dette apparat kan være nyttigt i situationer, hvor der er behov for mange hurtigt erhvervede analyser af cellers levedygtighed (3).
Det skal bemærkes, at cellers levedygtighed også kan vurderes med farvestoffer, der binder til DNA (ethidiummonoazid), midler, der binder til fosfatidylserin (Annexin V), og aminreaktive farvestoffer. Anvendelsen af disse alternative midler kræver normalt flowcytometri og kan derfor kun anvendes under særlige betingelser.
Trypanblå udelukkelse, som beskrevet i ovenstående protokol, kan udføres på 5-10 minutter.