PMC

Case presentation

Denne case report stammer fra et rutinemæssigt veterinærbesøg på en bedrift med 155 dyr, med to fåreracer (Pelifolk og Blackbelly), beliggende i Tesistán, kommunen Zapopan, staten Jalisco, Mexico. Faciliteterne på denne bedrift blev tilpasset fra en tidligere svinebedrift og er stadig omgivet af svine- og kvægbedrifter i det nære nabolag. Flokkene blev holdt på forhøjede gulve for at lette rengøring og håndtering, men der var mange ristede skarpe genstande (såsom tråd, ødelagte hegn, søm osv.) i staldene, og rengøringen blev ikke udført korrekt på bedriften på inspektionstidspunktet. Fodringen var baseret på lokalt tilgængelige foderstoffer, såsom grovfoder af lav kvalitet, svinegylle-silage og kommercielt kraftfoder med højt proteinindhold. Denne bedrift tilkaldte veterinærtjenesten på grund af hyppige hudabscesser hos dyrene, men der blev ikke rapporteret om andre klager i forbindelse med hudproblemer. Abscesser synes ikke at påvirke dyrenes produktivitet, men tilstedeværelsen af sådanne læsioner har en negativ indvirkning på dyrenes markedsføring, og derfor var ejeren interesseret i at finde ud af, hvad der var årsag til sygdommen, og hvilken behandling der anbefales for at fjerne sygdommen fra bedriften. En certificeret dyrlæge udtog prøver af indholdet af bylderne fra 31 dyr (29 moderfår, 1 vædder og 1 lam) og sendte dem til laboratoriet med henblik på bakteriologisk diagnose for at finde frem til de ætiologiske agenser, der forårsagede problemet. På grundlag af abscessernes udseende var den formodede infektionsdiagnose på bedriften for de fleste dyr kaseøs lymfadenitis . Den bakteriologiske analyse viste imidlertid, at 13 dyr var inficeret med C. pseudotuberculosis, 1 med Corynebacterium spp., 2 med Proteus spp. og 2 med Streptococcus spp., og i de resterende 13 tilfælde kunne patogenet ikke identificeres. Kategoriseringen for Corynebacterium spp.-isolatet var uklar, fordi resultaterne af de bakteriologiske og biokemiske undersøgelser ikke var konkluderende.

Denne artikel beskriver isolering af C. xerosis fra et 4 måneder gammelt Pelifolk-lam (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) i god kropskondition. Så vidt vi ved, er dette den første rapport om C. xerosis, der giver en klinisk kutan absces hos får. Der blev indhentet informeret samtykke fra dyrets ejer til offentliggørelse af resultaterne af den kliniske undersøgelse, herunder fotomateriale. Dyret havde en absces med hård konsistens uden afløb på venstre side af halsen (fig. 1a). Den indledende kliniske diagnose tydede på kaseøs lymfadenitis, muligvis forårsaget af C. pseudotuberculosis. Der blev udtaget en prøve til bakteriologisk analyse ved at punktere abscessen med en steril 5 ml sprøjte med en 20 gauge injektionsnål efter rengøring og desinfektion af abscessens overflade. Den type eksudat, der blev opsamlet, var serøst og hvidt i udseende. Den biologiske prøve blev opbevaret ved 4 °C indtil den biologiske karakterisering på Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, km 15,5 Toluca-Atlacomulco road, Toluca, Mexico, z.c. 50200). Tiden mellem prøvetagning og behandling var ikke længere end 72 timer. Prøven blev dyrket i to eksemplarer i 8 % fåreblodagar og inkuberet 24-48 timer ved 37 °C under aerobe og mikroaerofile forhold . Der blev observeret kolonier på 1,0 mm i diameter, ikke-hæmolytiske, gulbrune i farven og let tørre i udseendet (fig. 2a). Disse morfologiske karakteristika svarede ikke til dem, der tidligere er beskrevet for C. pseudotuberculosis, men de lignede snarere kolonier fra C. xerosis . Mikroskopisk (10× forstørrelse; fig. 2c) blev bakterierne observeret som kølleformede, pleomorfe, uregelmæssigt farvede Gram-positive stave med en kølleformet ende. Biokemiske test viste følgende resultater: Triple sugar Iron (TSI,-), Lysine Iron agar (LIA,-), Citrat test (CIT,-), Sulphide Indole-Motility (SIM,-), Motility, Indole, Ornitine (MIO,-), Oxidative-fermentative (OF,-), Methyl red (-), Peptonvand (-), Voger Pascaguer (-), urinstof (-), nitratbouillon (+), trehalose (+), saccharose (+), maltose (+) og glukosefermentering (positiv ved 37 °C og negativ ved 42 °C). Disse resultater kunne svare til en C. pseudotuberculosis-profil, med undtagelse af urinstofprøven, som var negativ i stedet for positiv, og som derfor bedre kunne svare til en C. xerosis-profil . De diagnostiske resultater var ikke entydige, og selv om API-systemet ikke er specifikt til at identificere C. xerosis , besluttede vi derfor at undersøge isolatet med dette system for at se, om dette isolat kunne identificeres som en anden Corynebacterium-art. For at finde ud af, om dette isolat tilhører andre arter som C. freneyi og C. amycolatum, der sjældent findes hos får, testede vi desuden, om kolonien kunne vokse ved 20 °C, og om den var i stand til at fermentere glukose ved 42 °C. Isolatet voksede fint ved 20 °C og fermenterede ikke glukose ved 42 °C, begge egenskaber, der er forbundet med C. xerosis og C. hansenii , og derfor besluttede vi at foretage en molekylær analyse for at finde ud af, om vi molekylært kunne identificere isolatet som C. xerosis. Vi analyserede tre loci for at øge vores diagnostiske nøjagtighed. Vi testede for et gen, der normalt ikke findes i C. xerosis, men som er til stede i C. pseudotuberculosis, nemlig pld-genet, hvor vi forventede ikke at finde nogen amplikon efter PCR-test, hvis isolatet var C. xerosis i modsætning til C. pseudotuberculosis. pseudotuberculosis, som vil amplificere et bånd på 203 bp; et andet locus var rettet mod amplifikation af den intergeniske spacerregion af 16S-23S rRNA-generne (16S-23S) ved hjælp af primere designet til C. pseudotuberculosis, som er blevet rapporteret ikke at fungere for C. xerosis , og vi ville også forvente intet amplifikationsbånd for C. xerosis og et bånd på 816 bp for C. pseudotuberculosis. Endelig udførte vi PCR-amplifikation og sekventering af rpoB-genet (446 bp), som tidligere er blevet rapporteret til at differentiere arter af Corynebacterium . DNA-ekstraktionen blev udført ved hjælp af et kommercielt kit (KAPA Express Extract) i henhold til producentens protokol. En multiplex-PCR-teknik til amplifikation af partielle sekvenser af pld-, 16S-23S- og rpoB-generne blev udført ved hjælp af den protokol, der blev offentliggjort af Pacheco i 2007 . Reaktioner blev udført ved hjælp af et kommercielt multiplex-PCR-kit (QIAGEN Multiplex PCR) i overensstemmelse med producentens specifikationer. PCR-analysen omfattede følgende prøver: Det isolat, der skal karakteriseres, det formodede C. xerosis-isolat og to C. pseudotuberculosis-isolater (et lokalt isolat, der tidligere er karakteriseret som biovar ovis, og en referencestamme, ATCC 43924, biovar equi), der blev anvendt som kontrol. Som forventet for den formodede C. xerosis blev et enkelt PCR-amplikonbånd på 446 bp, svarende til rpoB-genfragmentet, amplificeret, og de intergene 16S-23S gen- og pld-genfragmenter blev ikke amplificeret. Som forventet viste begge C. pseudotuberculosis-stammer også tre bånd på 203, 446 og 816 bp svarende til henholdsvis generne pld, rpoB og 16S (fig. 3). RpoB-genamplikoner fra alle tre prøver blev renset ved hjælp af Promega-rensningskit (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) og blev sendt til automatisk sekventering af Macrogen (Rockville, MD, USA). Flere sekvenstilpasninger, der blev opnået ved hjælp af BLAST (NCBI), blev analyseret sammen med vores isolatsekvenser ved hjælp af Clustal W-analyse fra Mega 6.0.6 (fig. 4). Den fylogenetiske analyse blev udført ved hjælp af nabosammenføjningsmetoden (MEGA-software 6.0.6). Bootstrap-værdier blev opnået ved at generere 1000 tilfældige træer. Den fylogenetiske analyse omfattede også sekvenserne fra rpoB-genet fra C. xerosis (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculosis biovar ovis (GenBank CP002924.1) og C. pseudotuberculosis biovar equi (GenBank CP003540.2). Det var muligt at observere forskellige fylogenetiske grupper, der svarede til bestemte arter af Corynebacterium. Disse resultater, bekræfter, at denne undersøgelses isolat (rpoB C53) er C. xerosis (fig. 4).

Genotypeteknikker som PCR samt sekvensanalyse af rpoB C53-isolat i denne undersøgelse bidrog i høj grad til en korrekt artsidentifikation, som oprindeligt var misvisende ved brug af fænotypiske mikroskopiske og biokemiske kendetegn. Corynebacterium xerosis er tidligere blevet rapporteret i kliniske prøver af humane tilfælde i læsioner i endokarditis, pneumonitis, osteomyelitis og hudinfektioner, især hos immunsupprimerede patienter . Det er også blevet fundet i kliniske prøver fra dyr, f.eks. i leverlæsioner hos geder (mistanke om pseudotuberkulose) og i komælk fra dyr med mastitis. Hos svin er C. xerosis blevet isoleret fra læsioner i forskellige væv såsom lever, nyre, lunge, milt og led samt fra subkutane abscesser. Desuden er C. xerosis blevet isoleret fra kliniske prøver af uterus fra får i et tilfælde af abort og fra lungevæv fra dyr med åndedrætsbesvær . Disse isolater blev identificeret og karakteriseret ved amplifikation af rRNA 16S-23S genet ved hjælp af PCR-RFLP. I disse undersøgelser var det imidlertid ikke muligt at opnå et båndmønster, der var tydeligt nok til at adskille C. xerosis fra andre arter af Corynebacterium. Forfatterne foretog også en analyse og sekvenssammenligning af generne 16S og rpoB, hvilket gjorde det muligt for dem at skelne C. xerosis fra andre arter, der genetisk ligner Corynebacterium .

Som nævnt ovenfor blev denne undersøgelse udført på grundlag af tilstedeværelsen af rpoB-genet, som er blevet rapporteret af andre forfattere som det foretrukne gen til fylogenetisk analyse af slægten Corynebacterium, da det udviser høj polymorfisme, endda større end den intergeniske spacer-region af 16S-23S rRNA-generne . Det er kendt, at kutan absces hos får (kaseøs lymfadenitis) forårsages af C. pseudotuberculosis, og at dens vigtigste virulens- og patogenicitetsfaktor er exotoksinet phospholipase D, der er kodet af pld-genet og udtrykkes i bakteriens cellemembran . Dette exotoksin er en permeabilitetsfaktor, der fremmer hydrolyse af esterbindingerne i sphingomyelin i pattedyrs cellemembraner, hvilket muligvis bidrager til spredningen af bakterier fra det oprindelige infektionssted til sekundære steder gennem lymfesystemet til regionale ganglier, og det synes at være involveret i reduktionen af makrofagernes levedygtighed efter infektion . Exotoxinet forårsager også dermonekrotiske læsioner . Dette exotoksin er imidlertid ikke blevet rapporteret hos C. xerosis som et patogent toksin, der kan bidrage til udviklingen af bylder. Dette understreger vigtigheden af at foretage yderligere forskning vedrørende de infektionsmekanismer, der findes hos denne Corynebacterium-art.

Et vigtigt diskussionspunkt af epidemiologisk karakter omfatter det faktum, at det produktionssystem for får, hvorfra prøven blev udtaget, tidligere blev anvendt til svin, en art, hvor C. xerosis er blevet rapporteret som et almindeligt patogen . Desuden omfatter en af hovedbestanddelene i fårefoderet svinebiprodukter (svinegylle-silage), som eventuelt kan indeholde aktive patogener, herunder måske Corynebacterium spp. Desuden er skarpe genstande såsom metalstænger, søm og ledninger udbredt overalt i anlægget, hvilket øger risikoen for, at dyrene kommer til skade, hvilket åbner en mulighed for, at Corynebacterium spp. kan komme ind i organismen, herunder C. xerosis. Alle disse faktorer kan have bidraget til tilstedeværelsen af C. xerosis i anlægget. Der blev ikke foretaget yderligere undersøgelser, men anbefalingerne til ejeren var at fjerne og desinficere bylder fra alle dyr i et område, der indeholder infektioner (for at undgå spredning af patogener), at styrke rengøringen af hegn og fjerne alle skarpe kanter og genstande fra hegn, foderautomater og gulve. Da C. xerosis og C. pseudotuberculosis er potentielt zoonotiske mikroorganismer, blev det anbefalet landmanden at træffe ekstreme forholdsregler ved håndtering af dyr og affald fra bedriften for at forhindre smitte af mennesker og dyr og eventuel spredning af mikroorganismen til andre bedrifter.