En metode til forebyggelse af PD’er består i fysisk-kemisk optimering af PCR-systemet, dvs. ændring af koncentrationerne af primere, magnesiumchlorid, nukleotider, ionisk styrke og reaktionens temperatur. Denne metode er i nogen grad begrænset af de fysisk-kemiske egenskaber, der også bestemmer effektiviteten af amplifikationen af målsekvensen i PCR’en. Derfor kan en reduktion af PD-dannelsen også resultere i en reduceret PCR-effektivitet. For at overvinde denne begrænsning har andre metoder kun til formål at reducere dannelsen af PD’er, herunder primerdesign og anvendelse af forskellige PCR-enzymsystemer eller reagenser.
PrimerdesignsoftwareRediger
Primerdesignsoftware anvender algoritmer, der kontrollerer potentialet for dannelse af sekundærstrukturer i DNA og annealing af primere til sig selv eller inden for primerparrene. Fysiske parametre, som softwaren tager hensyn til, er primernes potentielle selvkomplementaritet og GC-indhold, primernes lignende smeltetemperaturer og fravær af sekundære strukturer, f.eks. stammeløkker, i DNA-målsekvensen.
Hot-start PCREdit
Da primere er designet til at have lav komplementaritet til hinanden, kan de kun annealysere (trin I i figuren) ved lav temperatur, f.eks. stuetemperatur, som f.eks. under fremstillingen af reaktionsblandingen. Selv om de DNA-polymeraser, der anvendes i PCR, er mest aktive omkring 70 °C, har de også en vis polymeriseringsaktivitet ved lavere temperaturer, hvilket kan medføre DNA-syntese fra primere efter annealing til hinanden. Der er blevet udviklet flere metoder til at forhindre dannelse af PD’er, indtil reaktionen når arbejdstemperaturen (60-70 °C), og disse omfatter indledende hæmning af DNA-polymerasen eller fysisk adskillelse af reaktionskomponenterne, indtil reaktionsblandingen når de højere temperaturer. Disse metoder kaldes hot-start-PCR.
Voks: I denne metode er enzymet rumligt adskilt fra reaktionsblandingen ved hjælp af voks, der smelter, når reaktionen når høj temperatur.
Slow release of magnesium: DNA-polymerase kræver magnesiumioner for at være aktiv, så magnesium adskilles kemisk fra reaktionen ved at binde sig til en kemisk forbindelse og frigives først i opløsningen ved høj temperatur
Non-kovalent binding af inhibitor: Ved denne metode bindes et peptid, et antistof eller en aptamer ikke-kovalent til enzymet ved lav temperatur og hæmmer dets aktivitet. Efter en inkubation på 1-5 minutter ved 95 °C frigives inhibitoren, og reaktionen starter.
Koldfølsom Taq-polymerase: er en modificeret DNA-polymerase med næsten ingen aktivitet ved lav temperatur.
Kemisk modifikation: ved denne metode bindes et lille molekyle kovalent til sidekæden af en aminosyre i DNA-polymerasens aktive sted. Det lille molekyle frigøres fra enzymet ved inkubation af reaktionsblandingen i 10-15 minutter ved 95 °C. Når det lille molekyle er frigivet, aktiveres enzymet.
Strukturelle modifikationer af primereRediger
En anden metode til at forhindre eller reducere PD-dannelse er at modificere primerne, så annealing med dem selv eller hinanden ikke forårsager forlængelse.
HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System): En nukleotidhale, der er komplementær til 3′-enden af primeren, tilføjes til 5′-enden af primeren. På grund af 5′-haleens nærhed annealerer den til 3′-enden af primeren. Resultatet er en stamme-loop-primer, der udelukker annealing med kortere overlapninger, men tillader annealing af primeren til dens fuldt komplementære sekvens i målet.
Chimeriske primere: Nogle DNA-baser i primeren erstattes med RNA-baser, hvorved der skabes en chimær sekvens. Smeltetemperaturen for en kimær sekvens med en anden kimær sekvens er lavere end for en kimær sekvens med DNA. Denne forskel gør det muligt at indstille annealingstemperaturen således, at primeren annealerer til sin målsekvens, men ikke til andre kimære primere.
Blokkerede primere, der kan spaltes: Ved en metode, der er kendt som RNase H-afhængig PCR (rhPCR), anvendes en termostabil RNase HII til at fjerne en blokkeringsgruppe fra PCR-primerne ved høj temperatur. Dette RNase HII-enzym udviser næsten ingen aktivitet ved lav temperatur, hvilket gør, at fjernelsen af blokaden kun kan ske ved høj temperatur. Enzymet har også en iboende primer:skabelon-mismatch-diskrimination, hvilket resulterer i yderligere selektion mod primer-dimere.
Forebyggelse af signaloptagelse fra primer-dimereRediger
Mens ovenstående metoder er designet til at reducere PD-dannelse, har en anden tilgang til formål at minimere signal genereret fra PD’er i kvantitativ PCR. Denne fremgangsmåde er nyttig, så længe der dannes få PD’er, og deres hæmmende virkning på produktakkumulering er mindre.
Fire trin PCR: anvendes, når der arbejdes med uspecifikke farvestoffer som f.eks. SYBR Green I. Den er baseret på den forskellige længde og dermed forskellige smeltetemperatur af PD’erne og målsekvensen. Ved denne metode opnås signalet under smeltetemperaturen for målsekvensen, men over smeltetemperaturen for PD’erne.
Sekvensspecifikke sonder: TaqMan- og molekylære beacon-sonder genererer kun signal i tilstedeværelsen af deres målsekvens (komplementær), og denne øgede specificitet udelukker signaloptagelse (men ikke eventuelle hæmmende virkninger på produktakkumulering) fra PD’er.