Site-directed mutagenese (SDM) er en teknik, der bruges til at mutere en eller flere baser i et plasmid. Denne fremgangsmåde kan ændre aminosyresammensætningen, ødelægge transkriptionsfaktorbindingssteder eller skabe fusionsproteiner – for at nævne nogle få eksempler.
Og selv om SDM er mest udbredt til at undersøge strukturen og den biologiske aktivitet af nukleinsyrer og proteiner, er den også nyttig til at indføre eller fjerne genkendelsessteder for restriktionsenzymer for at lette kloning.
Dertil kommer, at SDM kan være et nyttigt kodonoptimeringsværktøj til at erstatte sjældne kodoner i ekspressionsvektorer for at forbedre ekspressionseffektiviteten af heterologe proteiner. Dette er undertiden nødvendigt på grund af codon bias, et fænomen, hvorved organismer har en præference for visse codoner frem for andre, afhængigt af tilgængeligheden af tRNA’er i cellen. Du kan læse mere om kodonbrug og kodonbias her.
Når SDM anvendes til at ændre kodningssekvensen, skaber SDM specifikke mutantkonstruktioner, der mangler kritiske rester eller proteindomæner, der er involveret i posttranslationelle modifikationer eller regulering af proteinets stabilitet. Fjernelse af kritiske rester eller områder i dine plasmider, f.eks. fosforyleringssteder eller kritiske domæner, er en måde at påvise betydningen af visse proteinfunktioner på. F.eks. giver ændring af fosforyleringssteder, f.eks. serin til ikke-reaktiv alanin eller til fosfomimetiske stoffer som asparaginsyre, pålidelige beviser for stedspecifik proteinfosforylering. Det giver mulighed for at studere in vitro-implikationer af sådanne posttranslationelle modifikationer.
Traditionelle metoder til stedbestemt mutagenese
Invers PCR
For deletion eller indsættelse af >50 bp er invers PCR den mest populære metode. Ved invers PCR anvendes back-to-back-primere til at amplificere hele plasmidet, efterfulgt af ligation af det lineære produkt, der danner cirkulært DNA. Denne teknik er også velegnet til større insertioner eller deletioner, f.eks. fjernelse af et regulatorisk domæne fra et protein.
For deletioner kan det udvalgte område fjernes ved at designe primere, der annealerer på hver side af den målrettede deletionszone. Amplifikationen foregår udad fra dette område og udelukker således dette område fra PCR-produktet. Når det lineære produkt er ligeret, vil dit nye konstrukt mangle dette deletionsområde. Denne proces er skitseret skematisk i figur 1 nedenfor.
Figur 1. Protokol for invers PCR i SDM.
Insertioner kan opnås ved at anvende overlappende primere med flankerende sekvenser, der indeholder de relevante ekstra baser. For yderligere oplysninger om invers PCR henvises til disse ressourcer:
- Ochman et al. (1998) Genetic Applications of an Inverse Polymerase Chain Reaction (Genetiske anvendelser af en invers polymerasekædereaktion). Genetics. 120:621-623.
- Clifford N. Dominy og David W. Andrews. Site-Directed Mutagenesis by Inverse PCR.
SDM Using Modified Primers
Denne teknik anvender modificerede primere til at inkorporere små baseparændringer i et plasmid og er den foretrukne metode til stedsspecifikke mutationer. Til at begynde med skal du designe nogle primere. Men før du går i gang:
- Udskriv en kopi af en aminosyrekodontabel
- Hav din plasmid- eller proteinsekvens klar.
- Sørg for, at du ved, hvor startkodonet er, og i hvilken læseramme din sekvens bliver læst.
Primerdesign
Søg efter SDM-primere med en længde på ca. 30 bp med dit muterede sted så tæt på midten som muligt. Selv om det er acceptabelt at lave primere lidt længere eller kortere efter behov, bør der være mindst 12 bp på hver side af dit muterede sted.
Hvis du har brug for hjælp til primerdesign, er der i http://molbiol-tools.ca/PCR.htm en liste over nogle meget nyttige ressourcer, der kan hjælpe dig på vej.
Vælg de rigtige reagenser
Ordinær Taq-polymerase er bare ikke nok, når det drejer sig om SDM – du skal bruge et korrekturlæsningsenzym. Der findes en række kommercielt tilgængelige polymerase-kits, som er i stand til at klare opgaven, og som indeholder en række funktioner, herunder høj fidelitet (proofreading-funktion) og hotstart-aktivering. En mulighed er Takaras In-Fusion HD Cloning Plus – en alt-i-en-løsning, der omfatter en høj-fidelitets polymerase, et PCR-rensningssæt, et kloningsenzym og kompetente celler til site-directed mutagenese.
Husk, at ligesom de fleste laboratoriereagenser har mange polymeraser deres egne fordele og ulemper – generelt vil laboratorier have historiske grunde til at vælge den ene frem for den anden og vil sjældent afvige fra dette. Selv om det er fornuftigt at holde sig til det, der virker, kan det ikke skade at læse litteraturen på andre tilgængelige ressourcer for at sikre, at du har de bedste reagenser til opgaven!
PCR-reaktion
De anvendte PCR-betingelser vil variere afhængigt af dit valg af kit og polymerase samt de primere, du har designet, og produktets størrelse. Det nedenfor viste eksempel er dog et godt udgangspunkt.
| Stræk | Temp (°C) | Tid (s) | Cyklusser | |
|---|---|---|---|---|
| Denaturering | 94 | 15 | 18 | |
| Annealing | 60 | 30 | 30 | 18 |
| Extension | 72 | 20/kb plasmid | 18 |
Tabel 1: Eksempel på SDM-termisk cyklusprogram
Hold antallet af cyklusser lavt for at forhindre uønskede mutationer i at opstå. Atten cyklusser skulle give en rimelig mængde muteret produkt uden at inkorporere uønskede mutationer. Bemærk, at antallet af cyklusser kan ændres under fejlfinding, hvis det er nødvendigt.
Digest It!
Nu, hvor du har dit PCR-produkt klar, må du ikke glemme det kritiske trin – fordøjelsen! Her digesterer du det forældede skabelon-DNA for at sikre, at du kun har det muterede plasmid til bakteriel transformation. Standardprotokoller kræver en 1 times inkubation ved 37 °C med endonuklease Dpn1 for at fordøje alt dam-methyleret og hemi-methyleret forældre-DNA, så du har dit ønskede muterede plasmid tilbage.
Transform og sekventering
Transform dit plasmid til kompetente celler, ligesom du ville gøre med ethvert andet ekspressionsplasmid, og isolér enkelte kolonier til plasmidisolering.
Nu bør du have en lille mængde af dit ønskede plasmid. Før du begynder at eksperimentere, skal du sende en prøve til sekventering for at bekræfte tilstedeværelsen af din ønskede modifikation(er). Det er lige så vigtigt at sikre, at der ikke er nogen sekundære uønskede mutationer.
Hvis sekventeringen vender tilbage med et positivt resultat – tillykke, du er en SDM-profil! Men hvis sekventeringen vender tilbage med et negativt resultat – så skal du ikke ærgre dig! Du kan altid prøve igen – vores eksperttips til fejlfinding af SDM bør få dig tilbage på sporet!
I dag betyder de faldende omkostninger til oligonukleotidsyntese og fremskridt inden for syntetisk biologi, at syntetiske tilgange vinder frem for stedbestemt mutagenese. Endvidere har fremkomsten af CRISPR/Cas9-teknologien også forenklet genredigering, således at mutagenese nu kan udføres in vitro og in vivo i nogle få enkle trin. Ikke desto mindre er SDM fortsat en grundpille i den molekylærbiologiske værktøjskasse og er ikke på vej nogen steder hen i den nærmeste fremtid.
Originalt offentliggjort i 2016. Opdateret og genudgivet i 2018.
Har dette hjulpet dig? Så del gerne med dit netværk.