Transwell-migrationsassayet er en klassisk teknik, der gør det muligt for forskere at kvantificere cellebevægelser. Migration henviser til en celles evne til at bevæge sig individuelt eller i klynger. Cellebevægelser er mulige gennem præcis omstrukturering af deres cytoskelet, og migration sker normalt som reaktion på stimuli, der fungerer som signaler.
I dag vil vi diskutere transwell-migrationsassayet, som anvender en simpel kammeropsætning til at vurdere migration som reaktion på tiltrækkende signaler.
Vi begynder med at give nogle baggrundsoplysninger om transwell-kammeret.
Apparatet blev først designet af Dr. Stephen Boyden i 1961, som brugte det til at studere leukocytmigration. Derfor er denne metode også kendt som Boyden-kammerassay.
I et simpelt Boyden-kammer består den ydre væg af brønde, ligesom dem i en 96-brønde-plade. Inde i hver brønd er der anbragt en transwell, som er en cylindrisk indsats. Indsatsen har en polycarbonatmembran med en defineret porestørrelse. Når den er placeret i brønden, opdeler den kammeret i to rum. Det øverste rum er det rum, hvor celler, hvis vandringsadfærd skal undersøges, vil blive udsået, og det nederste reservoir er det rum, hvor opløsningen af kemoattraktivt middel anbringes. Et kemoattraktivt stof er pr. definition et molekyle, der har evnen til at fremme cellemotilitet ved at “tiltrække celler”.
På grund af disse tiltrækningskræfter vandrer cellerne i det øverste rum gennem porerne ind i det nederste reservoir. Hvis cellerne har adhærente egenskaber, som f.eks. nogle melanomceller, vil de efter bevægelsen “klæbe” fast til membranens underside. I dette tilfælde kan membranen fikseres, farves, og cellerne kan tælles under mikroskopet. På den anden side vil ikke-hæftende celler, som f.eks. sædceller, vandre ind i bundreservoiret. I dette tilfælde kan cellerne i reservoiropløsningen tælles ved hjælp af et hæmocytometer.
Selv om opsætningen af dette forsøg er enkel, er der flere ting, som du skal overveje, før du udfører forsøget. Lad os gennemgå nogle af dem.
Du skal starte med seedningsopløsningen og sørge for, at tætheden er optimeret for at observere cellevandring. For få celler kan resultere i uopdagelig migration, og større tætheder vil overbefolke membranen, hvilket gør det vanskeligt at opregne migrationen. Den anden overvejelse er porestørrelsen på indsatsen. Den bør vælges omhyggeligt afhængigt af celletypen. Hvis porestørrelsen er for lille, vil cellerne ikke kunne passere igennem.
Alternativt, hvis porestørrelsen er for stor, vil cellerne bare falde igennem, hvilket ikke er migration. Endelig skal man være opmærksom på koncentrationen af det kemotiltrækkende stof og den inkubationstid, der skal gives til migration, da disse er indbyrdes afhængige. Optimal koncentration med passende inkubationstid, hvor der opretholdes en koncentrationsgradient mellem rummene, inducerer cellemigration som følge af kemotiltrækning. Omvendt kan langvarige inkubationer være ledsaget af en udligning af kemoattraktivt stof i hele kammeret, hvilket fører til tab af kemisk gradient, hvilket kan forvirre analysen af de opnåede resultater.
Med disse overvejelser i baghovedet skal vi diskutere en protokol, der anvendes til måling af migration af adhærente celler.
Celler, der skal analyseres, forberedes i et proteasefrit medium, da proteaser kan denaturere vigtige membranreceptorer og i sidste ende påvirke migrationen. Når cellerne er forberedt, skal suspensionen fortyndes til en optimal udsåningstæthed. For at forberede kammeret anbringes transwells i brønde på en multiwell-plade. Cellesuspensionen skal pipetteres ind i transwell’en uden at berøre membranen eller indføre luftbobler.
Chemoattraktantopløsningen pipetteres i det nederste reservoir, idet man sikrer sig, at opløsningen berører membranen i indsatsen. Inkubationstiden for migrationen vil afhænge af de eksperimentelle overvejelser. Efter inkubationen fikseres membranerne ved at dyppe indsatsen i 70 % ethanol. Efter at indsatsen har fået lov til at tørre, tilsættes cellefarvningsopløsning.
Næst inkuberes cellerne i ca. 30 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubationen vaskes indsatserne ved hjælp af vaskebuffer. Endelig kan membranen udskæres og anbringes på et objektglas. Cellerne på undersiden af membranen repræsenterer antallet af celler, der er vandret i tilstedeværelse og fravær af kemotiltrækkende stoffer.
Da du nu har en fornemmelse for protokollen, lad os tage et kort kig på, hvordan forskerne bruger denne metode i deres undersøgelser.
En af de mest almindelige anvendelser af dette assay er at evaluere kemotiltrækkende egenskaber af ukendte forbindelser. Her var forskerne interesseret i at undersøge frøspermiernes svømmebaner i nærvær af allurin, som er et stof, der udskilles af paddeæg. For at gøre dette pipetterede de først aktive frøspermier til toppen af transwell-indsatserne. I bunden tilsatte de allurin. Efter at have ladet cellerne vandre, talte de sædcellerne i reservoiropløsningen under et mikroskop. Ved hjælp af denne teknik var de i stand til at generere en koncentrations-respons kurve, der skildrer effekten af allurinkoncentrationen på sædvandring.
Når en celle angribes af patogener, udsender den kemotiltrækkende stoffer for at rekruttere immunceller, der migrerer, hæfter sig og efterfølgende løser infektionen. For at teste dette fænomen dyrkede disse forskere epithelceller på undersiden af indlæggene. Efterfølgende inficerede de disse celler med forskellige bakteriestammer. Endelig indførte de immunceller i det øverste kammer. Det er kendt, at de inficerede celler producerer flere kemotiltrækkende stoffer, der fremkalder immuncellemigration. Resultaterne af dette forsøg viste forskellige grader af neutrofil migration som reaktion på forskellige typer bakterieinfektion.
Sidst har kræftcellers invasion og metastase gennem den ekstracellulære matrix altid fascineret cellebiologer. Her ønskede forskerne at bestemme, hvordan specifikke kemoattraktanter kan bidrage til en sådan migration gennem en 3D-matrix. De har genetisk konstrueret to separate puljer af celler: den ene udtrykker grønt fluorescerende og den anden rødt fluorescerende protein. Derefter pipetterede de en ekstracellulær matrix-mimik på toppen af transwells.
Når den var størknet, vendte de transwell’en om og udsåede to puljer af celler på undersiden af membranen. Derefter satte de indsatsen tilbage i multiwell-pladen og pipetterede den kemotiltrækkende opløsning ind i det øverste kammer. Dette fik cellerne i bunden til at bevæge sig opad og gennem 3D-matrixen. Ved hjælp af konfokal billeddannelse rekonstruerede disse forskere cellevandringen i 3D og adskilte vandringsmønstrene for to grupper af celler.
Du har netop set JoVE’s video om transwell-migrationsforsøget. Med forståelsen af komponenterne og protokollen for denne metode ved du nu, hvorfor den er så udbredt blandt cellebiologer. På trods af denne opsætningens enkelhed gør de mange konfigurationer, som denne metode kan tilpasse sig, den uundværlig for undersøgelser af cellemobilitet. Som altid tak for at se med!