Das Riesenprotein Titin

Standardproteingele mit einem Acrylamidgehalt von 6 % bis 15 % wurden üblicherweise zum Nachweis von Proteinbanden im Bereich von 10 bis 200 kD verwendet. Da diese Methode den Nachweis größerer Proteine ausschließt, entdeckten Forscher erst vor zwei Jahrzehnten ein neuartiges Riesenprotein mit einer extrem niedrigen scheinbaren Mobilität, indem sie unkonventionelle 2 %-Gele verwendeten. Die Molekularmasse dieses neuen Proteins, Titin1 (auch als Connectin2 bezeichnet), wurde früher auf 1,2 bis 3,0 MD geschätzt (siehe Referenzen 3 und 4). Vergleicht man die Intensität der Titinbanden auf SDS-Gelen mit der anderer myofibrillärer Proteine, so zeigt sich, dass Titin nach Myosin und Aktin das am dritthäufigsten vorkommende Muskelprotein ist und ≈10 % des gesamten Muskelproteingehalts ausmacht. Ein erwachsener Mensch mit 80 kg Körpergewicht kann also etwa ein halbes Kilogramm Titin enthalten. In Anbetracht seiner Häufigkeit ist die späte Entdeckung von Titin recht überraschend.

In den 1980er Jahren hatten elektronenmikroskopische Untersuchungen mit titinspezifischen Antikörpern gezeigt, dass Titin ein integraler Bestandteil der Myofibrille ist. Einzelne Titinmoleküle spannen sich nachweislich von der Z-Scheibe bis zur M-Linie und bilden somit ein drittes sarkomeres Filamentsystem neben den dicken (meist Myosin) und dünnen (meist Aktin) Filamenten.5 Dementsprechend wurden gereinigte native Titinmoleküle, die elektronenmikroskopisch sichtbar gemacht wurden, als >1 μm lang befunden.6 Darüber hinaus erschienen diese Moleküle als Stäbchen mit einer wulstigen Substruktur,6 da ihre Peptidketten hauptsächlich aus Ig- und FN3-ähnlichen Wiederholungen bestehen,7 die sich zu globulären Domänen falten und fast 90 % der Titinmasse ausmachen (Abb. 1). Im A-Band sind diese Wiederholungen in hochgradig geordneten Mustern angeordnet und tragen zur Organisation der Dickfilamentstruktur bei, indem sie in regelmäßigen Abständen Bindungsstellen für andere A-Band-Proteine, insbesondere das leichte Meromyosin und das C-Protein, bereitstellen (siehe Referenz 15). Aufgrund der engen Verbindung mit den Dickfilamentproteinen ist der A-Band-Teil von Titin unter physiologischen Bedingungen funktionell steif. Im Gegensatz dazu ist der I-Band-Abschnitt von Titin elastisch.517 Wenn Titin-Filamente aus dem Sarkomer extrahiert oder durch Strahlung oder Proteasen abgebaut werden, nimmt die Steifigkeit der entspannten Myofibrille ab (für eine Übersicht siehe Referenzen 3 und 4). In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass Titin sowohl im Skelett- als auch im Herzmuskel den größten Teil der Ruhespannung während physiologischer Dehnungen trägt.1819

Molekulare Ansätze zur Untersuchung der Rolle von Titin in der Muskelstruktur und -elastizität sind nach der Bestimmung der cDNA-Sequenz menschlicher Skelett- und Herztitine einfacher geworden.8 Wie die unterschiedliche Beweglichkeit von Skelett- und Herztitin auf SDS-Gelen bereits vermuten ließ,2021 ist nun klar, dass Titin in verschiedenen Muskelgeweben in unterschiedlichen Isoformen exprimiert wird.8 Humanes Herztitin wird beispielsweise von einer riesigen 82-kb-mRNA kodiert, die einen 81-kb-offenen Leserahmen enthält, der für ein Peptid mit 27 000 Residuen (Mr, 2993 kD) kodiert. Im Gegensatz dazu ist das menschliche Soleus-Titin ein wesentlich größeres Polypeptid mit einer Molekularmasse von ≈3700 kD. Diese Unterschiede sind das Ergebnis einer Reihe von alternativen Spleißvorgängen des I-Band-Titins in den verschiedenen Muskelgeweben.8

Elastizität von Titin

Wenn entspannte quergestreifte Muskelfasern gedehnt werden, entsteht eine Rückzugskraft, die als passive oder Ruhespannung (Steifigkeit) bezeichnet wird. Es ist seit langem bekannt, dass der Herzmuskel viel steifer ist als der Skelettmuskel. Früher ging man davon aus, dass die hohe passive Steifigkeit des Herzmuskelgewebes vor allem auf die geringe Nachgiebigkeit extrazellulärer Strukturen wie Kollagen zurückzuführen ist22 , doch mit dem Aufkommen des Einzelmyozytenpräparats23 wurde klar, dass sich steife Strukturen zumindest teilweise innerhalb der Zelle befinden müssen.2425 Die steifen extrazellulären Elemente, die dazu beitragen, eine Überdehnung des Muskelgewebes zu verhindern, finden sich möglicherweise nur bei extremeren Belastungen. Kürzlich konnte auch gezeigt werden, dass sich bei der Dehnung entspannter, einzelner, isolierter Myofibrillen eine beträchtliche passive Kraft entwickelt, wobei Herzpräparate etwa eine Größenordnung steifer sind als Skelettpräparate.19 Diese Steifigkeitsunterschiede resultieren nach heutigem Kenntnisstand aus der muskeltypspezifischen Expression unterschiedlich langer Varianten von Titin oder, genauer gesagt, aus der unterschiedlichen Expression von zwei verschiedenen Titin-Motivfamilien im I-Band (Abb. 1).813 Ein Motivtyp wird durch tandemartig angeordnete Ig-Domänen repräsentiert. Der steifste quergestreifte Muskel der Wirbeltiere, das Herz, exprimiert 40 Tandem-Ig-Domänen, während der viel nachgiebigere Soleusmuskel 93 Tandem-Ig-Domänen exprimiert. Das andere unterschiedlich exprimierte I-Band-Titin-Segment ist ein besonderer Motivtyp, der als PEVK-Domäne bezeichnet wird, weil Prolin-, Glutamat-, Valin- und Lysinreste ≈70 % seiner Sequenz ausmachen.8 Diese PEVK-Domäne ist im Herzen am kürzesten und in der Skelettmuskulatur viel länger: Die PEVK-Region des menschlichen Herzens umfasst 163 Reste, während die PEVK-Region des menschlichen Fußsohlens ≈2200 Reste aufweist (Abb. 1).8

Die Entdeckung der unterschiedlichen Expression sowohl der PEVK- als auch der Tandem-Ig-Region von Titin hat es erforderlich gemacht, den relativen Beitrag dieser beiden unterschiedlichen I-Band-Segmente zur Elastizität der Myofibrillen zu ermitteln. Eine solche Identifizierung wurde kürzlich versucht, indem die Position ausgewählter I-Band-Titin-Antikörper-Epitope in gedehnten einzelnen Myofibrillen13 oder Muskelfasern14 zusätzlich zur Messung der passiven Spannungsreaktion der Proben überwacht wurde (Abb. 2; vgl. Referenz 13). Es wurde vermutet, dass sich die I-Band-Titin-Domänen bei schlaffer Sarkomerlänge in einem kompakten Zustand befinden, während eine geringe Dehnung eine Begradigung der Tandem-Ig-Regionen bewirken kann.13142728 Diese anfängliche Dehnung korreliert nur mit einer geringen (Herzmuskel) oder sogar vernachlässigbaren (Skelettmuskel) Zunahme der passiven Spannung202125 und kann daher nicht durch die Entfaltung der Tandem-Ig-Module verursacht werden, die sich nachweislich unabhängig voneinander zu thermodynamisch stabilen Domänen falten.9 Bei mäßigen bis langen Dehnungen scheint die Hauptausdehnung innerhalb der PEVK-Region stattzufinden, zumindest in Skelettmyofibrillen,1314 während die passive Spannung stetig zunimmt (Abb. 2). In kardialen Myofibrillen kann die kurze PEVK-Region8 auch die passive Spannung unterstützen, allerdings nur in begrenztem Maße (vgl. Legende zu Abb. 2). Sobald die Dehnbarkeit des PEVK-Segments erschöpft ist, könnte die passive Spannung hauptsächlich durch die Entfaltung der Ig-Domänen bestimmt werden2728 ; da jedoch die maximale Länge der kardialen Sarkomere in vivo ≈2,4 μm nicht überschreitet, ist eine solche Entfaltung unter physiologischen Bedingungen unwahrscheinlich.13

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hohe Dehnbarkeit der PEVK-Region bei physiologischer Dehnung1314 darauf hindeutet, dass diese Domäne in der Lage ist, sich zu einer verlängerten Polypeptidkette zu entfalten. Daher könnten die PEVK-Region von Titin und die Tandem-Ig-Domänen ein in Reihe geschaltetes Zweifedersystem bilden. Die gewebespezifische Ausprägung der beiden Federn in verschiedenen Längenvarianten kann nun erklären, warum die passiven mechanischen Eigenschaften der quergestreiften Muskeln so unterschiedlich sind. Die Expression unterschiedlicher Tandem-Ig-Segmentlängen in verschiedenen Muskeltypen könnte für die Einstellung der physiologischen schlaffen Sarkomerlänge wichtig sein, während das unterschiedliche Spleißen von PEVK-reichen Sequenzen die charakteristische Steifigkeit eines entspannten Muskelgewebes steuern könnte. Eine wichtige Aufgabe besteht nun darin, herauszufinden, welche Tertiärstruktur es der PEVK-Region des Titins ermöglicht, die massiven und schnell reversiblen Konformationsänderungen zu durchlaufen, die hauptsächlich die passive Spannung und Elastizität der Myofibrillen bestimmen.

Emerging Roles of Titin in Muscle Cell Biology

Gegenwärtig ist nicht bekannt, welche zelluläre Signaltransduktionsmaschinerie die Translation, den Zusammenbau und auch den Abbau und Umsatz des Riesen-Titin-Polypeptids während der Myogenese und des Wachstums kontrolliert. Titin enthält Hunderte von Bindungsstellen für Myosin-, C-Protein- und M-Linien-Proteine715 und wahrscheinlich für eine beträchtliche Anzahl noch nicht identifizierter Z-Scheiben- und I-Band-Proteine. Wie also steuert die Muskelzelle die Translation des 27 000 bis 33 000 Residuen umfassenden Titinpeptids, und wie kann die Titinsynthese während der Myogenese eng mit dem Aufbau von Titin-Liganden gekoppelt sein? Ein attraktives Modell wäre, dass Titin-, Myosin- und C-Protein-mRNAs kolokalisiert und kotranslational zusammengesetzt werden,29 wodurch die entstehenden Peptidketten in das Proteinnetzwerk der in vivo gefundenen parakristallinen Ordnung gezwungen werden. Ein besseres Verständnis darüber, wie die supramolekulare Anordnung von Titin und Dickfilamenten ein hoch geordnetes dreidimensionales Netzwerk bilden kann, muss nun durch eine biochemische Charakterisierung exprimierter Titin-, Myosin- und C-Protein-Fragmente und vielleicht durch Untersuchungen des Titin-MRNA-Stoffwechsels erreicht werden.

Ein weiterer Mechanismus zur Kontrolle des Zusammenbaus des Titinfilaments könnte sich aus einigen charakteristischen Merkmalen der Titinsequenz ergeben: Zusätzlich zur PEVK-Region und den 244 bis 297 Kopien von Ig- und FN3-Strukturwiederholungen (abhängig vom Muskeltyp) enthält Titin auch 19 einzigartige Sequenzinsertionen, die zusammen ≈300 kD oder 8 bis 10 % der Titinmasse ausmachen.8 Zwei einzigartige Sequenzinsertionen, die sich in der N-terminalen und C-terminalen Titinregion befinden, kodieren für tandemartig angeordnete SP-Motive (Abb. 1). Die Serinreste in den SP-Wiederholungen können in vitro durch Muskelextrakte phosphoryliert werden,3031 und dies könnte erklären, warum Titin in vivo schnell markiert wird, wenn Tieren Phosphat injiziert wird.32 Möglicherweise steuern daher noch nicht identifizierte Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungswege den Aufbau des Titinfilaments. In Zukunft sollte es interessant sein, die funktionellen Konsequenzen der Phosphorylierung an den Z-Scheiben- und M-Linien-Enden von Titin zu untersuchen.

Eine der einzigartigen Sequenzinsertionen von Titin, die sich in der Nähe des C-Terminus befindet, kodiert eine Serin/Threonin-Kinasedomäne (Abb. 1).7 Diese Domäne und die Organisation der flankierenden Ig- und FN3-Wiederholungen sind denen der riesigen Proteine der Wirbellosen, Twitchin und Projectin, sehr ähnlich.3334 In den Kinasedomänen sowohl von Twitchin als auch von Titin wurden Calmodulin-Bindungsstellen nachgewiesen.3536 Kürzlich wurde gezeigt, dass die Twitchin-Kinase aus dem Weichtier Aplysia durch den ubiquitären kalziumregulierten Cofaktor S100 um mehrere Größenordnungen aktiviert wird.37 Daher scheint es wahrscheinlich, dass die Twitchin- und vielleicht auch die Titin-Filamente ein neuartiges kalziumempfindliches Filamentsystem im Muskel darstellen. Trotz der zunehmenden Erkenntnisse über die Faktoren, die die Aktivität der Titin/Twitchin-Kinasen auf künstlichen Substraten kontrollieren, ist das eigentliche Substrat dieser Kinasen (und damit ihre physiologische Rolle) nach wie vor unbekannt.

Um die Physiologie des Auf- und Abbaus von Titin auf molekularer Ebene besser zu verstehen, könnte die Entdeckung spezifischer Bindungsstellen auf Titin für die Calpain-Protease p94,16 ein wichtiger Schritt sein (vgl. Abb. 1). Im Gegensatz zu den ubiquitären Calpains, die in allen Zelltypen vorkommen, wird p94 nur in Muskelgewebe exprimiert. Unter Verwendung von p94 als Köder für einen Hefe-Zwei-Hybrid-Screen wurden zwei unterschiedliche p94-Bindungsstellen auf dem Titinfilament identifiziert.16 Die erste Stelle befindet sich in der zentralen Region des I-Band-Titins. Möglicherweise erklärt die Spaltung von Titin an dieser Stelle durch p94 oder p94-regulierte Proteasen, warum Titin leicht zum so genannten T2-Titin (oder Beta-Connectin) abgebaut wird.3 T2 könnte dann ein physiologisches Abbauprodukt von Titin sein, das am myofibrillären Umsatz beteiligt ist. Darüber hinaus befindet sich die zweite Bindungsstelle auf Titin für p94 am C-terminalen Ende des Filaments, was mit der letzten einzigartigen Sequenzeinfügung von Titin zusammenfällt (Abb. 1). Obwohl es unklar ist, warum mindestens zwei verschiedene Bindungsstellen für p94 in Titin vorhanden sind, besteht die Möglichkeit, dass – da das lösliche p94 extrem schnell abbaubar ist und eine Halbwertszeit von 30 Minuten hat – die p94-Bindungsstellen in Titin dazu dienen, die Calpain-Protease in einem komplexierten, stabilisierten Zustand zu halten. Interessanterweise wird das C-terminale p94-Bindungsmotiv von Titin in einigen Muskelgeweben durch unterschiedliches Spleißen übersprungen,38 was die Wechselwirkungen zwischen p94 und Titin noch komplexer macht und die Möglichkeit einer gewebespezifischen Kontrolle der Titinstabilität aufwirft.

Pathophysiologische Aspekte

Ein molekulares Verständnis der Wechselwirkungen zwischen dem Titin-Filament und p94 oder anderen Calpain-Proteasen könnte uns schließlich zu einem gründlicheren Verständnis der Muskeldegeneration und -regeneration verhelfen, insbesondere im Hinblick auf die pathophysiologische Situation. Eine sorgfältige Untersuchung der Proteine in Muskelbiopsien von normalen und dystrophischen Patienten ergab einen Abbau von Titin bei DMD und FCMD.39 Vor kurzem wurde festgestellt, dass Mutationen in der muskelspezifischen Calpain-Protease p94 LGMD-2A verursachen.40 Da Titin spezifische Bindungsstellen für p94 bereitstellt,16 besteht die faszinierende Möglichkeit, dass genetisch unterschiedliche Muskeldystrophien wie FCMD, DMD und LGMD-2A eine Dysregulation der p94-Titin-Interaktion gemeinsam haben, die dann zu einer pathologischen Fragilität des Titinfilamentsystems als gemeinsamen, sekundären Krankheitsmechanismus führt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Titinfilamente sowohl für die physiologische als auch für die pathophysiologische Funktion der Muskeln eine wichtige Rolle spielen. Während eine regelmäßige Titinstruktur im A-Band für einen geordneten Aufbau des Sarkomers entscheidend zu sein scheint, ist es klar, dass die Elastizität des Titins im I-Band die passiven mechanischen Eigenschaften der Myofibrille bestimmt. Ein besseres molekulares Verständnis der elastischen Eigenschaften von I-Band-Titin könnte sich in Zukunft aus einem kombinierten Ansatz ergeben, bei dem sowohl biophysikalische als auch molekularbiologische Techniken eingesetzt werden. Was die potenzielle Kinaseaktivität von Titin und seine voraussichtliche Rolle bei der Signaltransduktion betrifft, so warten wir noch auf genauere Untersuchungen. Um schließlich die Beteiligung von Titin an pathophysiologischen Prozessen weiter aufzudecken, müssen exprimierte Titin-Module auf mögliche Interaktionen mit anderen myofibrillären und zytosolischen Proteinen untersucht werden, um diese Interaktionen auf molekularer Ebene funktionell zu charakterisieren.

Ausgewählte Abkürzungen und Akronyme

Fußnoten