The Giant Protein Titin

A 6-15% közötti akrilamidtartalmú standard fehérje géleket általában a 10 és 200 kD közötti fehérjesávok kimutatására használják. Mivel ez a módszer kizárja a nagyobb fehérjék kimutatását, a kutatók csak két évtizeddel ezelőtt fedeztek fel egy új, rendkívül alacsony látszólagos mobilitású óriásfehérjét a nem hagyományos 2%-os gélek alkalmazásával. Ennek az új fehérjének, a titin1 (más néven connectin2 ) molekulatömegét korábban 1,2 és 3,0 MD közöttire becsülték (áttekintésért lásd a 3. és 4. hivatkozást). Ha a titin sávok intenzitását az SDS-géleken összehasonlítjuk más myofibrilláris fehérjékével, úgy tűnik, hogy a titin a miozin és az aktin után a harmadik leggyakoribb izomfehérje, amely az összesített izomfehérje-tartalom ≈10%-át teszi ki. Egy 80 kg testsúlyú felnőtt ember tehát körülbelül fél kilogramm titint tartalmazhat. Tekintettel bőségére, a titin késői felfedezése meglehetősen meglepő.

Az 1980-as években titin-specifikus antitestekkel végzett elektronmikroszkópos vizsgálatok kimutatták, hogy a titin a myofibrillum szerves része. Kimutatták, hogy az egyes titinmolekulák a Z-korongtól az M-vonalig terjednek, így a vastag (főleg miozin) és a vékony (főleg aktin) filamentumok mellett egy harmadik szarkomerikus filamentumrendszert alkotnak.5 Ennek megfelelően az elektronmikroszkópiával láthatóvá tett tisztított natív titinmolekulák >1 μm hosszúnak bizonyultak.6 Továbbá ezek a molekulák gyöngyös alszerkezetű rúdként jelentek meg,6 mivel peptidláncaik főként Ig-szerű és FN3-szerű ismétlődésekből állnak,7 amelyek globuláris doménbe hajtódnak, és a titin tömegének közel 90%-át teszik ki (1. ábra). Az A-sávban ezek az ismétlődések rendkívül rendezett mintázatokba rendeződnek, és segítenek a vastagszálas szerkezet megszervezésében azáltal, hogy szabályos távolságban lévő kötőhelyeket biztosítanak más A-sávos fehérjéknek, nevezetesen a könnyű meromiozinnak és a C-proteinnek (áttekintésért lásd a 15. hivatkozást). A vastagszálas fehérjékkel való szoros társulás miatt a titin A-sávos része fiziológiás körülmények között funkcionálisan merev. Ezzel szemben a titin I-sávos szakasza rugalmas.517 Amikor a titin filamentumokat kivonják a szarkomerből, vagy sugárzás vagy proteázok által lebontják, a relaxált myofibrillum merevsége csökken (áttekintésért lásd a 3. és 4. hivatkozást). Újabban kimutatták, hogy a titin viseli a nyugalmi feszültség nagy részét a fiziológiás nyúlások során, mind a váz-, mind a szívizomban.1819

A titin izomszerkezetben és rugalmasságban betöltött szerepének vizsgálatára szolgáló molekuláris szintű megközelítések egyszerűbbé váltak, miután meghatározták a humán váz- és szívtitinek cDNS-szekvenciáját.8 Amint azt korábban a váz- és szívtitinek SDS-géleken mutatott eltérő mozgékonysága2021 már sejtette, ma már egyértelmű, hogy a titin különböző izoformákban fejeződik ki a különböző izomszövetekben.8 A humán szívtitint például egy óriási, 82 kb-os mRNS kódolja, amely egy 81 kb-os nyitott olvasókeretet tartalmaz, amely egy 27 000-residue peptidet (Mr, 2993 kD) kódol. Ezzel szemben a humán soleus titin lényegesen nagyobb polipeptid, molekulatömege ≈3700 kD. Ezek a különbségek a különböző izomszövetekben az I-sávú titin alternatív splicing eseménysorozatának eredményei.8

A titin rugalmassága

A laza harántcsíkolt izomrostok nyújtásakor visszahúzó erő keletkezik, amit passzív vagy nyugalmi feszültségnek (merevségnek) nevezünk. Régóta ismert, hogy a szívizom sokkal merevebb, mint a vázizom. Korábban úgy gondolták, hogy a szívizomszövet nagy passzív merevsége főként az extracelluláris struktúrák, például a kollagén alacsony megfelelőségéből ered,22 de az egysejtes szívizomsejt preparátum23 megjelenésével világossá vált, hogy a merev struktúráknak legalább részben a sejten belül kell elhelyezkedniük.2425 A merev extracelluláris elemek, amelyek segítenek megakadályozni az izomszövet túlnyújtását, csak szélsőségesebb feszültségek esetén találhatók meg. A közelmúltban azt is sikerült kimutatni, hogy a relaxált, egyes, izolált myofibrillumok nyújtásakor jelentős passzív erő alakul ki, és a szívminták körülbelül egy nagyságrenddel merevebbek, mint a csontvázpreparátumok.19 Ezek a merevségi különbségek ma már ismertek, és a titin különböző hosszúságú változatainak izomtípus-specifikus expressziójából, pontosabban az I sávban lévő két különböző titin motívumcsalád eltérő expressziójából erednek (1. ábra).813 Az egyik motívumtípust a tandemszerűen elrendezett Ig-domének képviselik. A legmerevebb gerinces harántcsíkolt izom, a szív 40 tandem-Ig-domént expresszál, míg a sokkal hajlékonyabb soleus-izom 93 tandem-Ig-domént. A másik differenciálisan expresszálódó I-sávos titin szegmens egy külön motívumtípus, amelyet PEVK-doménnek nevezünk, mivel szekvenciájának ≈70%-át prolin-, glutamát-, valin- és lizin-maradékok alkotják.8 Ez a PEVK-domén szintén a szívben a legrövidebb, a vázizomban pedig sokkal hosszabb: az emberi szív PEVK-régiója 163 maradékot tartalmaz, míg az emberi soleus PEVK-régiója ≈2200 maradékot (1. ábra).8

A titin PEVK- és tandem-Ig-régiójának eltérő expressziójának felfedezése szükségessé tette e két különböző I-sávos szegmens relatív hozzájárulásának meghatározását a myofibrillum rugalmasságához. Az ilyen azonosításra nemrégiben kísérletet tettek a kiválasztott I-sávos titin antitest-epitópok helyzetének nyomon követésével a megnyújtott egyes myofibrillumokban13 vagy izomrostokban,14 a minták passzív feszültségválaszának mérése mellett (2. ábra; vö. 13. hivatkozással). Azt feltételezték, hogy laza szarkomer hossznál az I-sávos titin domének kompakt állapotban vannak, míg kis nyújtás a tandem-Ig régiók kiegyenesedését idézheti elő.13142728 Ez a kezdeti megnyúlás csak kis (szívizom) vagy akár elhanyagolható (vázizom) passzív feszültségnövekedéssel korrelál202125 , és így nem feltétlenül a tandem-Ig modulok kibontakozása idézi elő, amelyekről kimutatták, hogy egymástól függetlenül termodinamikailag stabil doménné hajtódnak össze.9 Mérsékelt és hosszú nyúlásoknál úgy tűnik, hogy a fő nyúlás a PEVK-régióban történik, legalábbis a vázizomzat myofibrillumaiban1314 , miközben a passzív feszültség folyamatosan növekszik (2. ábra). A szívizomzat myofibrillumaiban a rövid PEVK régió8 is támogathatja a passzív feszültséget, de csak korlátozott mértékben (vö. a 2. ábra legendájával). Miután a PEVK szegmens nyújthatósága kimerült, a passzív feszültséget elsősorban az Ig-domének2728 kibontakozása határozhatja meg; mivel azonban a szívszarkomerek maximális hossza in vivo nem haladja meg a ≈2,4 μm-t, ilyen kibontakozás fiziológiás körülmények között valószínűleg nem történik.13

Összefoglalva, a PEVK régió nagyfokú nyújthatósága fiziológiás mennyiségű nyújtás1314 során arra utal, hogy ez a domén képes kibontakozni egy hosszú polipeptidlánccá. Ezért a titin PEVK régiója és a tandem-Ig domének egy sorozatban működő két rugós rendszert alkothatnak. A két rugó szövetspecifikus kifejeződése a különböző hosszváltozatokban most már magyarázatot adhat arra, hogy a harántcsíkolt izmok passzív mechanikai tulajdonságai miért olyan változatosak. A különböző tandem-Ig szegmensek különböző hosszúságú expressziója a különböző izomtípusokban fontos lehet a fiziológiás laza szarkomerhossz beállításában, míg a PEVK-dús szekvenciák eltérő splicingje szabályozhatja a relaxált izomszövet jellegzetes merevségét. Fontos feladat most annak feltárása, hogy a titin PEVK-régiója milyen tercier struktúra segítségével mehet keresztül azokon a masszív és gyorsan reverzibilis konformációs változásokon, amelyek alapvetően meghatározzák a myofibrilláris passzív feszültséget és rugalmasságot.

A titin kialakuló szerepe az izomsejtek biológiájában

Most nem ismert, hogy milyen sejtes jelátviteli gépezetek irányíthatják az óriás titin-polipeptid transzlációját, összeszerelését, valamint szétszerelését és turnoverét a miogenezis és a növekedés során. A titin több száz kötőhelyet tartalmaz a miozin, a C-protein és az M-vonal fehérjék715 számára, valamint valószínűleg egy jelentős számú, még nem azonosított Z-korong és I-sávú fehérje számára. Hogyan szabályozza tehát az izomsejt a 27 000-33 000-residue titin peptid transzlációját, és hogyan lehet a titin szintézise szorosan összekapcsolva a titin ligandumok összeszerelésével a miogenezis során? Egy vonzó modell az lenne, hogy a titin, a miozin és a C-fehérje mRNS-ek kolokalizálódnak és kotranszlációsan összeállnak,29 ezáltal a naszcens peptidláncokat az in vivo talált parakristályos rendben lévő fehérjehálózatba kényszerítik. Nyilvánvaló, hogy annak jobb megértéséhez, hogy a titin/vastagszálas szupramolekuláris összeszerelés hogyan képes magas rendezettségű háromdimenziós hálót alkotni, most az expresszált titin, miozin és C-fehérje fragmentumok biokémiai jellemzéséből és talán a titin mRNS-metabolizmusának vizsgálatából kell kiindulni.

A titin filamentum összeszerelésének szabályozását szolgáló másik mechanizmusra utalhat a titin szekvencia néhány jellegzetes tulajdonsága: a PEVK régió és az Ig és FN3 szerkezeti ismétlődések 244-297 példánya mellett (izomtípustól függően) a titin 19 egyedi szekvencia inszerciót is tartalmaz, amelyek együttesen ≈300 kD-t, vagyis a titin tömegének 8-10%-át teszik ki.8 Az N-terminális és C-terminális titin régiókban található két egyedi szekvencia inszerció tandemszerűen elrendezett SP motívumokat kódol (1. ábra). Az SP ismétlődések szerin-maradványai in vitro izomkivonatokkal foszforilálhatók,3031 és ez magyarázhatja, hogy a titin in vivo miért válik gyorsan jelöltté, amikor foszfátot injektálnak állatokba.32 Lehetséges, hogy eddig még nem azonosított foszforilációs/defoszforilációs útvonalak így szabályozzák a titin filamentumok összeállását. A jövőben érdekes lenne megvizsgálni a titin Z-korong és M-vonal végi foszforilációjának funkcionális következményeit.

A titin egyik egyedi szekvencia-beillesztése, amely a C-terminus közelében található, egy szerin/ treonin kináz domént kódol (1. ábra).7 Ez a domén és a flankáló Ig és FN3 ismétlődések szerveződése nagyon hasonlít a gerinctelen óriásfehérjék, a twitchin és a projectin szerveződéséhez.3334 Mind a twitchin, mind a titin kinázdomainjában kalmodulin-kötőhelyeket mutattak ki.3536 Nemrégiben kimutatták, hogy az Aplysia puhatestűből származó twitchin kináz több nagyságrenddel aktiválódik a mindenütt jelenlévő kalcium-szabályozott S100 kofaktoron keresztül.37 Ezért valószínűnek tűnik, hogy a twitchin- és talán a titin-filamentumok egy új kalcium-érzékeny filamentumrendszert képviselnek az izomban. Annak ellenére, hogy egyre több ismeretünk van a titin/twitchin kinázok aktivitását mesterséges szubsztrátokon szabályozó tényezőkről, e kinázok valódi szubsztrátja (és így fiziológiai szerepük) továbbra sem ismert.

A titin összeszerelés/lebontás fiziológiájának jobb megértéséhez molekuláris szinten fontos lépés lehet a kalpain proteáz, a p94,16 számára a titinen található specifikus kötőhelyek felfedezése (vö. 1. ábra). A minden sejttípusban kifejeződő ubiquitárius kalpainokkal ellentétben a p94 csak az izomszövetekben fejeződik ki. A p94-et csaliként használva egy élesztő two-hybrid screenben két különböző p94-kötőhelyet azonosítottak a titin filamentumon.16 Az első hely az I-sávos titin központi régiójában található. Lehetséges, hogy a titinnek ezen a helyen a p94 vagy a p94 által szabályozott proteázok általi hasítása magyarázhatja, hogy a titin miért bomlik le könnyen az úgynevezett T2 titinné (vagy béta-konnektinné).3 Ezután a T2 a titin fiziológiás bomlásterméke lehet, amely részt vesz a myofibrilláris turnoverben. Továbbá a titin második kötőhelye a p94 számára a filamentum C-terminális végén található, ami egybeesik a titin utolsó egyedi szekvencia-beillesztésével (1. ábra). Bár nem világos, hogy miért van legalább két különböző kötőhely a p94 számára a titinben, az egyik lehetőség az, hogy – mivel az oldható p94 rendkívül gyorsan lebomlik és felezési ideje 30 perc – a titinben lévő p94-kötőhelyek a kalpain-proteáz komplex stabilizált állapotba történő szekvenálását szolgálják. Érdekes módon a titin C-terminális p94-kötő motívuma egyes izomszövetekben a differenciális splicing révén kimarad,38 ami a p94 és a titin közötti kölcsönhatások további komplexitását növeli, és felveti a titin stabilitásának szövetspecifikus szabályozásának lehetőségét.

Patofiziológiai szempontok

Végezetül a titin filamentum és a p94 vagy más kalpain proteázok közötti kölcsönhatások molekuláris megértése az izomdegeneráció és regeneráció alaposabb megértésével jutalmazhat bennünket, különös tekintettel a patofiziológiai helyzetre. A normális és dystrophiás betegekből származó izombiopsziákban jelen lévő fehérjék gondos felmérése kimutatta a titin degradációját DMD-ben és FCMD-ben.39 Nemrégiben az izomspecifikus p94 kalpain proteáz mutációit találták az LGMD-2A okozójának40 . Mivel a titin specifikus kötőhelyeket biztosít a p94 számára,16 felmerül az az érdekes lehetőség, hogy a genetikailag különböző izomdisztrófiák, mint az FCMD, DMD és LGMD-2A, a p94-titin kölcsönhatás diszregulációjában osztoznak, ami aztán a titin filamentumrendszer kóros törékenységéhez vezet, mint közös, másodlagos betegségmechanizmus.

Összefoglalva, a titin filamentumok fontos szerepet játszanak mind az izom fiziológiás, mind a patofiziológiai működésében. Míg az A-sávban lévő szabályos titinszerkezet kritikusnak tűnik a szarkomer rendezett felépítéséhez, egyértelmű, hogy az I-sávban lévő titin rugalmassága határozza meg a myofibrillum passzív mechanikai tulajdonságait. A jövőben az I sávú titin rugalmas tulajdonságainak jobb molekuláris megértése a biofizikai és a molekuláris biológiai technikák kombinált megközelítéséből fejlődhet ki. Ami a titin potenciális kinázaktivitását és a jelátvitelben betöltött várható szerepét illeti, még várunk a részletesebb feltárásra. Végül, a titin patofiziológiai folyamatokban való részvételének további feltárásához szükséges lesz az expresszált titinmodulok vizsgálata más myofibrilláris és citoszolikus fehérjékkel való lehetséges kölcsönhatások szempontjából, ezáltal e kölcsönhatások molekuláris szintű funkcionális jellemzése.

Kiválasztott rövidítések és rövidítések

Footnotes

.