La proteína gigante Titina

Los geles de proteínas estándar con un contenido de acrilamida que oscila entre el 6% y el 15% se han utilizado habitualmente para detectar bandas de proteínas en el rango de 10 a 200 kD. Dado que este método excluye la detección de proteínas de mayor tamaño, no fue hasta hace dos décadas que los investigadores descubrieron una nueva proteína gigantesca con una movilidad aparente extremadamente baja utilizando geles no convencionales del 2%. La masa molecular de esta nueva proteína, la titina1 (también denominada conectina2 ), se estimó anteriormente entre 1,2 y 3,0 MD (para revisiones, véanse las referencias 3 y 4). Cuando se compara la intensidad de las bandas de titina en los geles SDS con la de otras proteínas miofibrilares, resulta que la titina es, después de la miosina y la actina, la tercera proteína muscular más abundante, constituyendo ≈10% del contenido proteico muscular combinado. Así, un adulto humano de 80 kg de peso corporal puede contener aproximadamente medio kilo de titina. Teniendo en cuenta su abundancia, el descubrimiento tardío de la titina es bastante sorprendente.

Durante la década de 1980, los estudios de microscopía electrónica con anticuerpos específicos de titina habían demostrado que la titina es una parte integral de la miofibrilla. Se demostró que las moléculas individuales de titina se extienden desde el disco Z hasta la línea M, formando así un tercer sistema de filamentos sarcoméricos, aparte de los filamentos gruesos (en su mayoría miosina) y finos (en su mayoría actina).5 En consecuencia, se ha comprobado que las moléculas nativas purificadas de titina visualizadas por microscopía electrónica tienen una longitud de >1 μm.6 Además, estas moléculas aparecen como una varilla con una subestructura de cuentas,6 porque sus cadenas peptídicas están compuestas principalmente por repeticiones tipo Ig y FN3,7 que se pliegan en dominios globulares y representan casi el 90% de la masa de la titina (Fig. 1). En la banda A, estas repeticiones están dispuestas en patrones altamente ordenados y ayudan a organizar la estructura del filamento grueso proporcionando sitios de unión regularmente espaciados a otras proteínas de la banda A, especialmente la meromiosina ligera y la proteína C (para una revisión, véase la Referencia 15). Debido a la estrecha asociación con las proteínas del filamento grueso, la parte de la banda A de la titina es funcionalmente rígida en condiciones fisiológicas. Por el contrario, la sección de la banda I de la titina es elástica.517 Cuando los filamentos de titina se extraen del sarcómero o se degradan por radiación o proteasas, la rigidez de la miofibrilla relajada disminuye (para revisiones, véanse las Referencias 3 y 4). Más recientemente, se ha demostrado que la titina soporta la mayor parte de la tensión en reposo durante las extensiones fisiológicas, tanto en el músculo esquelético como en el cardíaco.1819

Los enfoques a nivel molecular para investigar el papel de la titina en la estructura y la elasticidad del músculo se han facilitado tras la determinación de la secuencia del ADNc de las titinas esqueléticas y cardíacas humanas.8 Como se sugirió anteriormente a partir de las diferentes movilidades de las titinas esqueléticas y cardíacas en los geles SDS,2021 ahora está claro que la titina se expresa en diferentes isoformas en varios tejidos musculares.8 La titina cardíaca humana, por ejemplo, está codificada por un ARNm gigante de 82 kb, que contiene un marco de lectura abierto de 81 kb que codifica un péptido de 27 000 residuos (Mr, 2993 kD). En cambio, la titina del sóleo humano es un polipéptido significativamente mayor, con una masa molecular de ≈3700 kD. Estas diferencias son el resultado de una serie de eventos de splicing alternativo de la titina de la banda I en los diferentes tejidos musculares.8

Elasticidad de la titina

Cuando se estiran las fibras musculares estriadas relajadas, se produce una fuerza de retracción, que se denomina tensión pasiva o de reposo (rigidez). Hace tiempo que se sabe que el músculo cardíaco es mucho más rígido que el músculo esquelético. Anteriormente, se pensaba que la elevada rigidez pasiva del tejido muscular cardíaco se debía sobre todo a la escasa complacencia de las estructuras extracelulares, como el colágeno,22 pero con la llegada de la preparación de un solo miocito,23 quedó claro que las estructuras rígidas deben estar localizadas, al menos parcialmente, dentro de la célula.2425 Los elementos extracelulares rígidos, que ayudan a evitar el sobreestiramiento del tejido muscular, pueden encontrarse sólo en tensiones más extremas. Recientemente, también se ha podido demostrar que se desarrolla una fuerza pasiva significativa al estirar miofibrillas relajadas y aisladas, siendo las muestras cardíacas aproximadamente un orden de magnitud más rígidas que las preparaciones esqueléticas.19 Ahora se sabe que estas diferencias de rigidez son el resultado de la expresión específica del tipo de músculo de variantes de titina de diferente longitud o, más precisamente, de la expresión diferencial de dos familias distintas de motivos de titina en la banda I (Fig. 1).813 Un tipo de motivo está representado por dominios Ig dispuestos en tándem. El músculo estriado más rígido de los vertebrados, el corazón, expresa 40 dominios Ig en tándem, mientras que el músculo sóleo, mucho más flexible, expresa 93 dominios Ig en tándem. El otro segmento de titina de la banda I que se expresa de forma diferencial es un tipo de motivo distinto denominado dominio PEVK, porque los residuos de prolina, glutamato, valina y lisina constituyen ≈70% de su secuencia.8 Este dominio PEVK también es más corto en el corazón y mucho más largo en el músculo esquelético: la región PEVK cardíaca humana comprende 163 residuos, mientras que la región PEVK del sóleo humano tiene ≈2200 residuos (Fig. 1).8

El descubrimiento de la expresión diferencial de las regiones PEVK y tándem-Ig de la titina ha hecho necesario identificar la contribución relativa de estos dos segmentos distintos de la banda I a la elasticidad de la miofibrilla. Dicha identificación se ha intentado recientemente mediante el seguimiento de la posición de epítopos seleccionados de la banda I de la titina en miofibrillas individuales estiradas13 o en fibras musculares,14 además de la medición de la respuesta de tensión pasiva de las muestras (Fig. 2; compárese con la referencia 13 ). Se sugirió que a una longitud de sarcómero floja, los dominios de titina de la banda I están en estado compacto, mientras que un pequeño estiramiento puede inducir el enderezamiento de las regiones de tándem-Ig.13142728 Esta extensión inicial se correlaciona con un aumento de la tensión pasiva pequeño (músculo cardíaco) o incluso insignificante (músculo esquelético) solamente202125 y, por lo tanto, puede no ser provocado por el despliegue de los módulos de tándem-Ig, que se ha demostrado que se pliegan independientemente en dominios termodinámicamente estables.9 En tramos de moderados a largos, la principal extensión parece producirse dentro de la región PEVK, al menos en las miofibrillas esqueléticas,1314 mientras que la tensión pasiva aumenta de forma constante (Fig. 2). En las miofibrillas cardíacas, la corta región PEVK8 también puede soportar la tensión pasiva, pero sólo en un grado limitado (compárese con la leyenda de la Fig. 2). Una vez agotada la extensibilidad del segmento PEVK, la tensión pasiva podría estar determinada principalmente por el desdoblamiento de los dominios Ig2728 ; sin embargo, dado que la longitud máxima de los sarcómeros cardíacos no supera ≈2,4 μm in vivo, es poco probable que dicho desdoblamiento se produzca en condiciones fisiológicas.13

En conclusión, la alta extensibilidad de la región PEVK durante cantidades fisiológicas de estiramiento1314 sugiere que este dominio es capaz de desdoblarse en una cadena polipeptídica extendida. Por lo tanto, la región PEVK de la titina y los dominios tándem-Ig pueden constituir un sistema de dos resortes que actúan en serie. La expresión específica para cada tejido de ambos resortes en diferentes variantes de longitud puede explicar ahora por qué las propiedades mecánicas pasivas de los músculos estriados son tan diversas. La expresión de diferentes longitudes de segmentos tándem-Ig en varios tipos de músculos podría ser importante para establecer la longitud fisiológica del sarcómero flojo, mientras que el empalme diferencial de las secuencias ricas en PEVK podría controlar la rigidez característica de un tejido muscular relajado. Una tarea importante ahora es descubrir qué estructura terciaria permite que la región PEVK de la titina sufra los cambios conformacionales masivos y rápidamente reversibles que determinan principalmente la tensión pasiva y la elasticidad miofibrilar.

Roles emergentes de la titina en la biología de las células musculares

En la actualidad, se desconoce qué maquinaria de transducción de señales celulares puede controlar la traducción, el ensamblaje y también el desensamblaje y el recambio del polipéptido gigante de titina durante la miogénesis y el crecimiento. La titina contiene cientos de sitios de unión para la miosina, la proteína C y las proteínas de la línea M715 y probablemente para un número importante de proteínas del disco Z y de la banda I aún no identificadas. ¿Cómo controla entonces la célula muscular la traducción del péptido de titina de 27.000 a 33.000 residuos, y cómo puede la síntesis de titina estar estrechamente acoplada con el ensamblaje de los ligandos de titina durante la miogénesis? Un modelo atractivo sería que los ARNm de la titina, la miosina y la proteína C se colocan y se ensamblan de forma cotranslacional,29 forzando así las cadenas peptídicas nacientes en el entramado proteico del orden paracristalino encontrado in vivo. Claramente, una mejor comprensión de cómo el ensamblaje supramolecular titina/filamento grueso es capaz de constituir una malla tridimensional altamente ordenada debe venir ahora de una caracterización bioquímica de los fragmentos expresados de titina, miosina y proteína C y quizás de estudios del metabolismo del ARNm de la titina.

Otro mecanismo para controlar el ensamblaje del filamento de titina podría estar implícito en algunos rasgos característicos de la secuencia de la titina: además de la región PEVK y de las 244 a 297 copias de repeticiones estructurales de Ig y FN3 (dependiendo del tipo de músculo), la titina también contiene 19 inserciones de secuencia únicas, que en conjunto constituyen ≈300 kD, o del 8% al 10%, de la masa de la titina.8 Dos inserciones de secuencia únicas, situadas en las regiones N-terminal y C-terminal de la titina, codifican motivos SP dispuestos en tándem (Fig. 1). Los residuos de serina en las repeticiones SP pueden ser fosforilados in vitro por extractos musculares,3031 y esto podría explicar por qué la titina se marca rápidamente in vivo cuando se inyecta fosfato en los animales.32 Posiblemente, las vías de fosforilación/desfosforilación aún no identificadas pueden así controlar el ensamblaje del filamento de titina. En el futuro, será interesante investigar las consecuencias funcionales de la fosforilación en los extremos del disco Z y de la línea M de la titina.

Una de las inserciones de secuencia únicas de la titina, situada cerca del extremo C, codifica un dominio de serina/treonina quinasa (Fig. 1).7 Este dominio y la organización de las repeticiones de Ig y FN3 que lo flanquean son muy similares a los de las proteínas gigantes de invertebrados, twitchin y projectin.3334 En los dominios de quinasa tanto de la twitchina como de la titina, se han demostrado sitios de unión a la calmodulina.3536 Recientemente, se ha demostrado que la twitchina quinasa del molusco Aplysia se activa en varios órdenes de magnitud a través del cofactor omnipresente regulado por el calcio S100.37 Por lo tanto, parece probable que los filamentos de la twitchina -y quizás también de la titina- representen un nuevo sistema de filamentos sensibles al calcio en el músculo. A pesar de los crecientes conocimientos sobre los factores que controlan la actividad de las quinasas de titina/twitchina en sustratos artificiales, el sustrato genuino de estas quinasas (y, por tanto, su función fisiológica) sigue siendo desconocido.

Para comprender mejor la fisiología del ensamblaje/desensamblaje de la titina a nivel molecular, el descubrimiento de sitios de unión específicos en la titina para la proteasa calpaína, p94,16 podría ser un paso importante (comparar con la Fig. 1). A diferencia de las calpaínas ubicuas que se expresan en todos los tipos de células, la p94 sólo se expresa en los tejidos musculares. Utilizando la p94 como cebo para una pantalla de dos híbridos de levadura, se identificaron dos loci de unión de p94 distintos en el filamento de titina.16 El primer sitio está localizado en la región central de la banda I de titina. Posiblemente, la escisión de la titina en este sitio por p94 o por proteasas reguladas por p94 puede explicar por qué la titina se degrada fácilmente a la llamada titina T2 (o beta-conectina).3 Entonces, la T2 podría ser un producto fisiológico de descomposición de la titina implicado en el recambio miofibrilar. Además, el segundo sitio de unión de la titina a la p94 se encuentra en el extremo C-terminal del filamento, coincidiendo con la última inserción de secuencia única de la titina (Fig. 1). Aunque no está claro por qué hay al menos dos sitios de unión distintos para la p94 en la titina, una posibilidad es que -dado que la p94 soluble se degrada muy rápidamente y tiene una vida media de 30 minutos- los sitios de unión a la p94 en la titina pueden funcionar para secuestrar la proteasa calpaína en un estado estabilizado complejo. Curiosamente, el motivo de unión a p94 en el extremo C de la titina se omite en algunos tejidos musculares por empalme diferencial,38 lo que añade un nivel más de complejidad a las interacciones entre p94 y titina y plantea la posibilidad de un control de la estabilidad de la titina específico para cada tejido.

Aspectos fisiopatológicos

Por último, una comprensión molecular de las interacciones entre el filamento de titina y la p94 u otras proteasas de la calpaína puede recompensarnos con una comprensión más profunda de la degeneración y regeneración muscular, con especial respeto a la situación fisiopatológica. Un cuidadoso estudio de las proteínas presentes en las biopsias musculares de pacientes normales y distróficos reveló la degradación de la titina en la DMD y la FCMD.39 Más recientemente, se descubrió que las mutaciones en la calpaína proteasa específica del músculo p94 causan la LGMD-2A.40 Dado que la titina proporciona sitios de unión específicos para p94,16 se plantea la intrigante posibilidad de que distrofias musculares genéticamente distintas, como la FCMD, la DMD y la LGMD-2A, compartan una desregulación de la interacción p94-titina, lo que conduce a una fragilidad patológica del sistema de filamentos de titina como mecanismo común y secundario de la enfermedad.

En resumen, los filamentos de titina desempeñan un papel importante en el funcionamiento tanto fisiológico como fisiopatológico del músculo. Mientras que una estructura regular de titina en la banda A parece ser crítica para un ensamblaje ordenado del sarcómero, está claro que la elasticidad de la titina en la banda I determina las propiedades mecánicas pasivas de la miofibrilla. En el futuro, una mejor comprensión molecular de las propiedades elásticas de la titina de la banda I podría evolucionar a partir de un enfoque combinado, utilizando tanto técnicas biofísicas como de biología molecular. En cuanto a la potencial actividad quinasa de la titina y su previsible papel en la transducción de señales, todavía estamos a la espera de una exploración más detallada. Por último, para seguir descubriendo la implicación de la titina en los procesos fisiopatológicos, será necesario estudiar los módulos de titina expresados en busca de posibles interacciones con otras proteínas miofibrilares y citosólicas, caracterizando así funcionalmente esas interacciones a nivel molecular.

Abreviaturas y acrónimos seleccionados

Notas