Amesin testi on biologinen määritys, jolla arvioidaan kemiallisten yhdisteiden mutageenista potentiaalia. Siinä käytetään bakteereja testaamaan, voiko tietty kemikaali aiheuttaa mutaatioita testattavan organismin DNA:ssa. Testin kehitti Bruce N. Ames 1970-luvulla sen määrittämiseksi, onko käsillä oleva kemikaali mutageeni.
Tavoite
Kemikaalien mutageenisen aktiivisuuden määrittäminen havainnoimalla, aiheuttavatko ne mutaatioita näytebakteereissa.
Periaate
- Amesin testissä käytetään useita bakteerikantoja (Salmonella, E.coli), jotka kantavat tiettyä mutaatiota.
- Histidiini- (Salmonella typhimurium) tai tryptofaani- (Escherichia coli) operoniin tehdään pistemutaatioita, jolloin bakteeri ei kykene tuottamaan vastaavaa aminohappoa.
- Nämä mutaatiot johtavat his- tai trp-organismeihin, jotka eivät pysty kasvamaan, ellei histidiiniä tai tryptofaania anneta.
- Mutta His- Salmonellan viljely tietyt kemikaalit sisältävässä väliaineessa aiheuttaa histidiiniä koodaavassa geenissä mutaation siten, että ne saavat takaisin kyvyn syntetisoida histidiiniä (His+). Tämä tarkoittaa sitä, että kun mutageeninen tapahtuma tapahtuu, emästen korvautuminen tai kehyssiirtymät geenissä voivat aiheuttaa paluun aminohappoprototrofiaan. Tämä on käänteismutaatio.
- Tällöin nämä revertoituneet bakteerit kasvavat vastaavasti histidiini- tai tryptofaanipuutteisissa väliaineissa.
Näytteen mutageeninen potentiaali arvioidaan altistamalla aminohappoja vaativia organismeja vaihteleville pitoisuuksille kemikaalia ja valitsemalla reversiotapahtuma. Tähän valintaan käytetään väliaineita, joista puuttuu tietty aminohappo, jolloin vain histidiini-/tryptofaaniprototrofiaan palautumisen läpikäyneet solut voivat selviytyä ja kasvaa. Jos testinäyte aiheuttaa tämän palautumisen, se on mutageeni.
Menetelmä
I ) Eristetään Salmonella Typhimuriumin auxotrofinen kanta histidiinin suhteen. (ts. His-ve)
II) Valmistetaan testisuspensio His-ve Salmonella Typhimuriumista tavalliseen puskuriin, jossa on testikemikaali (esim. 2-aminofluoriini). Lisää myös pieni määrä histidiiniä.
Huom: pieni määrä histidiiniä tarvitaan, jotta bakteeri alkaa kasvaa. Kun histidiini on loppunut, vain ne bakteerit, jotka ovat mutatoituneet saamaan kyvyn syntetisoida histidiiniä, muodostavat pesäkkeitä.
III) Valmistetaan myös kontrollisuspensio His-ve Salmonella Typhimuriumista, mutta ilman testikemikaaleja.
IV) Inkuboidaan suspensioita 37 °C:ssa 20 minuuttia
V) Valmistetaan kaksi agarilevyä ja levitetään suspensio agarilevylle.
VI) Inkuboidaan levyjä 37 °C:ssa 48 tuntia.
VII) 48 tunnin kuluttua lasketaan pesäkkeiden määrä kummallakin levyllä.
Tulosten tulkinta
- Kemikaalien mutageenisuus on verrannollinen havaittujen pesäkkeiden määrään.
- Jos testilevyllä on suuri määrä pesäkkeitä verrattuna kontrolliin, sanotaan, että kyseinen kemikaali on mutageeninen.
- Hyvin harvat pesäkkeet näkyvät myös kontrollilevyllä. Tämä voi johtua spontaanista pistemutaatiosta hisidiiniä koodaavassa geenissä.
Käyttökohteet
Vaikka Amesin testiä käytetään kannoissa esiintyvien reversiibelien mutaatioiden tunnistamiseen, sitä voidaan käyttää myös ympäristönäytteiden, kuten lääkkeiden, väriaineiden, reagenssien, kosmeettisten valmisteiden, jäteveden, torjunta-aineiden ja muiden nestemäisessä suspensiossa herkästi liukenevien aineiden mutaatioiden osoittamiseen.
Hyötyjä
- Yksinkertainen, nopea ja kestävä bakteerimääritys.
- Testin helppous ja alhaiset kustannukset tekevät siitä korvaamattoman arvokkaan ympäristössämme olevien aineiden seulonnassa mahdollisen karsinogeenisuuden varalta.
- Ames-testillä voidaan havaita sopivia mutaatioita suuressa bakteeripopulaatiossa suurella herkkyydellä.
rajoitteet
- Jotkut aineet, jotka aiheuttavat syöpää koe-eläimissä (esimerkiksi dioksiini), eivät anna positiivista Ames-testiä (ja päinvastoin)
- Ames-testi koostuu Salmonella typhimurium -bakteerikannoista, joten se ei ole täydellinen malli ihmiselle.