GyrB:n ja GyrA:n ekspressio ja puhdistus
Täyspitkän E. coli GyrA:n (2-875) koodaava sekvenssi lisättiin modifioituun pET28b:hen, joka sisälsi N-terminaalisen 10-His-tunnisteen (10-His tag) ja C-terminaalisen Twin-strep-tagin. Yliekspressio suoritettiin E. coli BL21 (DE3) pRARE2:ssa LB-mediassa, joka sisälsi 50 µg/ml kanamysiiniä ja 35 µg/ml kloramfenikolia. Solut indusoitiin 0,35 mM IPTG:llä sen jälkeen, kun OD600 oli saavuttanut 0,85, ja proteiini ekspressoitiin 37 °C:ssa 4 tunnin ajan. Solut kerättiin ja resuspendoitiin lyysipuskuriin (20 mM hepes, 500 mM NaCl, 20 mM imidatsoli, 10 % v/v glyseroli, pH 8,0) ja lysoitiin kolmella syklillä korkeapainekatkaisua käyttäen EmulsiFlex-C3:a, jonka nopeus oli 1500 bar. GyrA-proteiini puhdistettiin nikkeli-affiniteettikromatografialla manuaalisesti pakatulla XK 26/20-kolonnilla (Pharmacia), jossa oli Ni2+-ioneihin sitoutunutta kelatoivaa Sepharose 6 Fast Flow -hartsia (GE Healthcare). Eluointi suoritettiin lyysipuskurilla, joka sisälsi 250 mM imidatsolia pH 8,0, ja eluoituneet proteiinit kiinnitettiin suoraan 10 ml:n Streptavidin Sepharose (GE Healthcare) -kolonniin. Proteiinit pestiin laajasti Strep-puskurilla (20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 % v/v glyseroli, pH 8,0) ja eluoitiin Strep-puskurilla, joka sisälsi 3 mM destiobiotiinia (Sigma-Aldrich). Sekä 10-His-tunniste että Twin-strep-tunniste pilkottiin tämän jälkeen PreScission-proteaasilla (P3C) ja Tobacco Etch -viruksen (TEV) pilkkomisella (massasuhde 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) yön yli 4 °C:ssa. Tämän jälkeen GyrA puhdistettiin edelleen anioninvaihtokromatografialla HiTrap Q HP -kolonnilla (GE Healthcare). Proteiini eluoitiin lineaarisella gradientilla, joka koostui 20 kolonnitilavuudesta puskurilla B (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 % v/v glyseroli, pH 8,0). GyrA:ta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja ladattiin Superdex S200 16/60 -kokoekskluusiokromatografiapylvääseen (GE Healthcare), jossa käytettiin 20 mM Hepesiä, 50 mM NaGlu:ta, 50 mM KAc:ta, 1 mM EDTA:ta, 0,5 mM DTT:tä, 10 %:n tilavuusprosenttia glyserolia, pH 8,0. 37 mg GyrA:ta saatiin 3 L:n viljelmistä. GyrB:tä (2-804) koodaava sekvenssi lisättiin samaan muunnettuun pET28b:hen. Yliekspressio suoritettiin E. coli BL21 (DE3) pRARE2:ssa LB-mediassa, joka sisälsi 50 µg/ml kanamysiiniä ja 35 µg/ml kloramfenikolia. Solut indusoitiin 0,35 mM IPTG:llä sen jälkeen, kun OD600 oli saavuttanut arvon 0,85, ja proteiini ekspressoitiin 18 °C:ssa 18 h. GyrB:n puhdistusmenetelmä on kuvattu edellä GyrA:n osalta. GyrB:tä saatiin 10 mg 3 L:n viljelmistä.
Täydellinen DNA-gyraasin rekonstituutio
E. coli GyrA ja GyrB sekoitettiin ekvimolaarisessa suhteessa täydellisen DNA-gyraasin rekonstituution mahdollistamiseksi. Kompleksi puhdistettiin edelleen Superdex S200 16/60 -kokoekskluusiokromatografiakolonnilla (GE Healthcare) käyttäen kryo-EM-puskuria (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0,5 mM TCEP, pH 8,0) (Kuva 1 ja Supplementary Fig. 1).
Nukleiinihapon valmistelu
Kaksinkertainen 180 bp:n DNA-dupleksi rekonstruoitiin käyttämällä kahta fosforyloitua epäsymmetristä synteettistä synteettistä oligonukleotidia12 , jotka saatiin Sigma-Aldrichilta (lisätaulukko 1). Lyhyesti sanottuna nukleiinihapot liuotettiin DNAse-vapaaseen veteen 1 mM:n pitoisuutena. Kaksijuosteisen DNA:n kokoamiseksi kukin oligo sekoitettiin moolisuhteessa 1:1, anneerattiin inkuboimalla 95 °C:ssa 2 minuutin ajan ja laskemalla lämpötilaa sitten 1 °C:lla minuutin välein, kunnes lämpötila oli 20 °C:ssa. Tämän jälkeen annealoitu kaksoissidoksinen DNA-dupleksi puskurivaihdettiin Hepes 20 mM pH 8.0:ssa BioSpin 6 -kolonnilla (BioRad).
Kompleksin muodostaminen kryo-EM:ää varten
Puhdistettu DNA-gyraasi sekoitettiin 180 bp:n dsDNA:n kanssa 1:1-molaarisessa suhteessa siten, että proteiinien ja DNA:n loppukonsentraatioksi saatiin 32 µM. Seosta inkuboitiin 10 minuuttia 37 °C:ssa. Gepotidasiinia (GSK2140944, ostettu MedChemExpressistä), joka oli resuspensiossa 10 mM 100-prosenttisessa DMSO:ssa, lisättiin, jotta loppupitoisuus olisi 170 µM (1,7 % DMSO). Seosta inkuboitiin 10 minuutin ajan 37 °C:ssa. Kompleksiin lisättiin AMP-PNP (Sigma), jonka lopullinen pitoisuus oli 340 µM. Täysin rekonstruoitua kompleksia inkuboitiin edelleen 30 min 30 °C:ssa. Lopuksi kompleksiin lisättiin 8 mM CHAPSO (Sigma-Aldrich). Näytettä sentrifugoitiin 2 h 16 000 × g:ssa mahdollisten aggregaattien poistamiseksi.
Cryo-EM-ristikon valmistelu
Quantifoil R-1.2/1.3 300 mesh -kuparistikkoja hehkutettiin 20 s ajan ennen 4 µl:n kompleksin levittämistä. 30 sekunnin inkubaation jälkeen ritilät pakastettiin nestemäiseen etaaniin Vitrobot mark IV -laitteella (FEI) 95 %:n kammiokosteudessa 10 °C:n lämpötilassa.
Elektronimikroskopia
Kryo-EM-kuvaus suoritettiin 300 kV:n jännitteellä toimivalla Titan Krios -mikroskoopilla (FEI), joka oli varustettu K2 Summit -suoraelektronikameralla (Gatan), GIF Quantum -energiasuodattimella (Gatan), jota käytettiin nollaenergiahäviömoodissa ja jonka raon leveys oli 20 e-V, Volta-faasilevyllä (FEI) ja CS-korjaimella (FEI). Kuvat tallennettiin EFTEM-nanosonditilassa Serial EM53:lla superresoluutiolaskentatilassa 130 000-kertaisella nimellissuurennuksella superresoluutiopikselin koon ollessa 0,44 Å ja -500 nm:n kiinteän defokuskohteen ollessa -500 nm (täydentävä kuva 2c). VPP:tä siirrettiin uuteen asentoon 100 minuutin välein (täydentävä kuva 2b). Detektorille kerättiin neljä datasarjaa annosnopeudella 6-8 e-/pikseli/s (0,88 Å:n pikselikoko näytteessä). Kuvat tallennettiin kokonaisannoksella 50 e/Å2 , valotusajalla 7-10 sekuntia ja 0,2-0,25 sekunnin alakuvilla (yhteensä 35-50 kuvaa). Kaikkiaan tallennettiin 11 833 filmiä neljän tietokokonaisuuden tiedonkeruun jälkeen.
Tiedonkäsittely
Kunkin tietokokonaisuuden tietojenkäsittely tehtiin erikseen noudattaen samaa menettelyä 3D-parannuksiin asti, jolloin hiukkaset yhdistettiin. Superresoluution annosfraktioidut alakuvat vahvistuskorjattiin IMOD54:llä ja binnoitettiin kahdesti Fourier-croppingilla, driftikorjattiin ja annospainotettiin MotionCor255:llä, jolloin saatiin summattuja kuvia, joiden pikselikoko oli 0,88 Å. Korjattujen mikrokuvien kontrastinsiirtofunktio arvioitiin käyttämällä GCTF v1.0656 -ohjelmaa. Thon-renkaat tarkastettiin manuaalisesti astigmatismin varalta, ja mikrokuvat, joiden mitattu resoluutio oli huonompi kuin 4 Å, hylättiin, jolloin jäljelle jäi 8 701 mikrokuvaa. Hiukkaset poimittiin automaattisesti RELION229,30:n referenssivapaalla Gaussin blob picking-protokollalla. Kun kaikki neljä tietokokonaisuutta otetaan huomioon, valittiin yhteensä 1 572 962 hiukkasta. Kustakin tietokokonaisuudesta neljä kertaa niputetuille hiukkasille tehtiin erikseen kaksi kierrosta 2D-luokittelua RELION2-ohjelmassa roskahiukkasten ja kontaminaatioiden poistamiseksi, jolloin saatiin yhteensä 479 667 hiukkasta jatkokäsittelyä varten. Neljän tietokokonaisuuden hiukkaset yhdistettiin yhdeksi ainutkertaiseksi tietokokonaisuudeksi, jonka jälkeen hiukkaset erotettiin uudelleen keskittämällä ne 3 × 3:een niputettuun muotoon. Tämän jälkeen suoritettiin viimeinen 2D-luokittelukierros, jonka tuloksena saatiin 338 616 hiukkasta koostuva lopullinen hiukkaspino. Seuraavalle hiukkaspinolle tehtiin yksi kierros 3D-ab-initio-luokittelua cryoSPARC31 -ohjelmassa. Kun huonolaatuiset mallit oli hylätty, jäljelle jääneen ab-initio-mallin tuloksena oli 191 456 hiukkasen lopullinen tietopaketti, jonka luokkatodennäköisyyskynnys oli 0,9 (täydentävä kuva 2a). Ab-initio-malli suodatettiin alipäästösuodattimella 30 Å:iin, ja sitä käytettiin referenssinä cryoSPARC-ohjelmassa suoritettavassa homogeenisessa hienosäädössä, jonka tuloksena saatiin 5,4 Å:n kartta. Tarkennettuja hiukkaskoordinaatteja käytettiin sitten paikallisen CTF:n estimointiin GCTF v1.06:n avulla, minkä jälkeen 2 × 2 binnattuihin hiukkasiin tehtiin uusi uuttaminen keskittämällä ne. Tälle uudelle hiukkaspinolle tehtiin 3D-automaattinen hienosäätö RELION2-ohjelmassa käyttäen ab-initio-mallia, joka alipäästösuodatettiin 30 Å:iin, jolloin saatiin kartta, jonka globaali resoluutio oli 5,0 Å (täydentävä kuva 3). Paikallinen resoluutio vaihteli 4,0 Å:sta 4,0 Å:sta DNA:ta sitovassa/purkaavassa ytimessä 9,0 Å:iin ATPaasidomeenissa ja DNA:ta kietovassa GyrA:n β-pinwheelissä, mikä viittaa näiden kahden moduulin suureen joustavuuteen. Saadaksemme lopullisen rekonstruktion koko kompleksista, jossa on hyvin määritellyt tiheydet kullekin domeenille, suoritimme 3D-luokittelun ilman kohdistusta, jolloin saatiin useita eri luokkia. Kolmen luokan hiukkaset yhdistettiin (94 633 hiukkasta). Tämän jälkeen 1 × 1-binoitua hiukkaspinoa tarkennettiin RELION2:ssa ilman maskia, kunnes myöhäisissä tarkennusiteraatioissa käytettiin pehmeää maskia resoluution parantamiseksi. Kartan jälkikäsittelyn tuloksena saatiin 6,6 Å:n resoluution rekonstruktio kokonaiskompleksista (Supplementary Fig. 3).
Käytettiin erilaisten paikallisten lähestymistapojen yhdistelmää erilaisten konformaatioiden tunnistamiseksi ja kunkin domainin paikallisen resoluution parantamiseksi. Koska ATPaasidomeeni oli liian pieni fokusoitua 3D-jalostusta varten, suoritimme ensin fokusoidun 3D-luokituksen ATPaasidomeenille pehmeällä maskilla ja ilman kohdistusta RELION2:ssa. Valittiin yksi 58 329 hiukkasesta koostuva luokka, jossa ATPaasi-domeenin tiheys oli hyvin määritelty, minkä jälkeen 1 × 1-binoidut hiukkaset erotettiin uudelleen, jolloin saatiin hiukkasia, joiden pikselikoko oli 0,88 Å/pikseli. Hiukkasten tarkan kohdistamisen helpottamiseksi tätä luokkaa tarkennettiin edelleen RELION2:ssa käyttämällä pehmeää maskia ATPaasidomeenin ja DNA:ta sitovan/puhdistavan domeenin ympärillä, jolloin saatiin 5,9 Å:n globaaliresoluutiokartta (ATPase-Core) (Täydentävä kuva 3).
Toiseksi suoritettiin kohdennettu 3D-luokitus GyrA:n β-piikkirenkaasta käyttäen pehmeää maskia ja ilman kohdistusta RELION2:ssa. Valittiin yksi 45 040 hiukkasesta koostuva luokka, jossa GyrA β-pinwheelin tiheys oli hyvin määritetty, minkä jälkeen 1 × 1-binoidut hiukkaset uutettiin uudelleen, jolloin saatiin hiukkasia, joiden pikselikoko oli 0,88 Å/pikseli. Tätä luokkaa tarkennettiin edelleen RELION2:ssa käyttämällä pehmeää maskia β-pinwheelin ja DNA:ta sitovan/cleavage-domeenin ympärillä, jolloin saatiin 6,3 Å:n resoluutiokartta (CTD-Core) (Täydentävä kuva 3).
Lopuksi RELION2:ssa suoritettiin kohdennettu 3D-automaattinen tarkennus käyttämällä pehmeää maskia DNA:ta sitovan/cleavage-domeenin ympärillä. Kartan jälkikäsittely tuotti 4,3 Å:n resoluution rekonstruktion DNA:ta sitovasta/cleavage-domeenista. Tämän jälkeen suoritettiin DNA:ta sitovan/cleavage-domeenin tarkennettu 3D-luokittelu. Kaksi luokkaa osoitti paremmat kulmatarkkuudet ja DNA:ta sitovan/cleavage-domeenin erilliset suljetut (60 548 hiukkasta) ja avautumista edeltävät konformaatiot (53 655 hiukkasta). Näitä kahta luokkaa tarkennettiin edelleen RELION2-ohjelmassa keskittyneellä 3D-jalostuksella, jossa käytettiin C2-symmetriaa ja jossa käytettiin 1 × 1 binnattuja hiukkasia, ja jälkikäsittelyn jälkeen saatiin rekonstruktiot, joiden globaali resoluutio oli 4,0 ja 4,6 Å (täydentävä kuva 3). Suljettua DNA:ta sitovaa/purkautuvaa domeenia tarkennettiin edelleen fokusoidulla 3D-jalostuksella käyttäen pehmeää maskia, joka sulkee pois järjestäytymättömän TOPRIM-insertion, jolloin saatiin 4,0 Å:n kartta, joka on korkealaatuinen (lisäyskuva 3).
Kaikki ilmoitetut resoluutiot perustuvat kultaiseen standardiin FSC-0,143-kriteeriin57 , ja FSC-käyrät korjattiin pehmeän maskin konvoluutiovaikutusten osalta käyttämällä korkean resoluution kohinasubstituutiota58 RELION2:ssa sekä cryoSPARC:ssa (Täydentävä kuva 4a). Kaikki rekonstruktiot terävöitettiin käyttämällä negatiivista B-kerrointa, joka arvioitiin automaattisten menettelyjen avulla59. Karttojen paikallinen resoluutio laskettiin Blocres-ohjelmalla60 (täydentävä kuva 4c). Kryo-EM-kartat kokonaiskompleksista, ATPaasiytimestä, CTD-ytimestä ja DNA:ta sitovasta/purkautuvasta domeenista suljetussa (TOPRIM-insertion kanssa ja ilman TOPRIM-insertion kanssa) ja avautumista edeltävässä tilassa on talletettu EM Data Bank -tietopankkiin liittymisnumeroilla EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909 ja EMD-4912.
Mallin rakentaminen ja tarkentaminen
4,0 Å:ssa ratkaistun TOPRIM-insertiota sisältämättömän DNA:ta sitovan/halkaisevan domeenin EM-rekonstruktio oli laadultaan paras. Lähes kaikki sivuketjut näkyivät ja Gepotidacin tiheys näkyi selvästi. Tätä karttaa käytettiin E. coli DNA-gyraasin DNA:ta sitovan/purkautuvan domeenin17 kiderakenteen tarkentamiseen. DNA:ta sitovan/purkaavan domeenin dimeerinen atomimalli luotiin PDB 3NUH:n avulla PyMol-ohjelmassa (Schrodinger L.L.C.). Seuraavasta atomimallista poistettiin TOPRIM-insertioon kuuluvat aminohapot, kaikki ionit ja vesimolekyylit, ja kaikki miehitykset asetettiin arvoon 1 ja B-faktorit arvoon 50. Ensin atomimalli sovitettiin jäykkärunkoisesti suodatettuun ja terävöitettyyn karttaan Chimera61 -ohjelmalla. Ensimmäinen reaaliavaruuden tarkennuskierros PHENIX-ohjelmassa62 suoritettiin käyttäen paikallista reaaliavaruuden sovitusta ja globaalia gradienttiohjattua minimointitarkennusta. Sitten 20 nukleiinihappoa S. aureus DNA gyraasin41 (PDB 5IWM) rakenteesta kopioitiin ja sovitettiin atomimalliimme. DNA-sekvenssi muutettiin rakenteessamme käytetyn DNA:n mukaisesti. Puuttuvat proteiinijäämät ja nukleiinihapot rakennettiin manuaalisesti COOT63:ssa. Gepotidasiinin (GSK-2140944) atomimalli ja rajoitussanasto luotiin Grade-palvelimella (http://grade.globalphasing.org). Gepotidasiini sovitettiin sitten manuaalisesti tyhjään elektronitiheyteen COOTissa ja monistettiin sitten. Molemmat duplikaatit asetettiin 0,5 miehitykseen. PHENIX-ohjelmassa tehtiin useita kierroksia reaalitilan tarkennusta käyttäen sekundäärirakenteen, rotameerien, Ramachandranin ja ei-kiteisen symmetrian rajoituksia, minkä jälkeen tehtiin aina manuaalinen tarkistus COOT-ohjelmassa, kunnes saatiin konvergoituva malli. Lopuksi B-faktorit tarkennettiin viimeisellä kierroksella PHENIXissä reaalitilan tarkennuksella käyttäen samoja asetuksia kuin aiemmin. Kun tarkennus oli konvergoitunut, TOPRIM-lisäyksen atomikoordinaatit lisättiin atomimalliin. Sitä tarkennettiin edelleen EM-rekonstruktioissa, jotka sisälsivät insertin tiheyden suljetuissa ja esi-avoimissa tiloissa, käyttäen samaa menettelyä. Puolikartan ristiinvalidointi suoritettiin 1,5:n määrittelemiseksi parhaaksi PHENIXin tarkennuspainoksi, joka mahdollistaa atomien yhteentörmäysten vähentämisen ja mallin ylisovittamisen estämisen (täydentävä kuva 4e). Kaikissa tarkennusvaiheissa käytettiin rekonstruktioiden resoluutiorajaa kultaisen standardin FSC-0.143-kriteerin57 mukaisesti. Tarkennusparametrit, mallitilastot ja validointipisteet on esitetty tiivistetysti lisätaulukossa 2. E. coli DNA:ta sitovan/purkautuvan domeenin atomimallit suljetussa (insertiolla ja ilman insertiota) ja avautumista edeltävässä konformaatiossa on talletettu Protein Data Bankiin liittymisnumeroilla 6RKU, 6RKS ja 6RKV.
Kokonaiskompleksin osalta käytimme yhdistelmää erilaisten EM-rekonstruktioiden yhdistelmää rakentaaksemme DNA-gyraasin kokonaiskompleksin atomimallin. ATPaasi-ytimen rakennetta, joka oli ratkaistu 5,9 Å:n tarkkuudella, käytettiin jäykän kappaleen sovittamiseen Chimerassa ATPaasi-domeenin kiderakenteen sovittamiseen kompleksissa ADPNP32:n kanssa (PDB 1EI1) ja DNA:ta sitovan/purkautuvan domeenin sovittamiseen, joka oli puhdistettu suljetussa konformaatiossa. Elektronitiheyden laadun ansiosta COOT:ssa voitiin rakentaa ATPaasidomeenin ja DNA:ta sitovan/purkautuvan domeenin välisen linkkerin puuttuvat jäännökset. 6,3 Å:n tarkkuudella ratkaistua CTD-ytimen rakennetta käytettiin β-pinwheel-kiderakenteen10 tarkkaan rigid-body-sovittamiseen Chimerassa. GyrA-boxin jälkeen puuttuvat 10 aminohappoa (564-574) lisättiin Phyre264-mallinnuspalvelimella. Elektronitiheyden laatu mahdollisti sen, että COOT:iin voitiin rakentaa puuttuvat nukleiinihapot β-piikkipyörän ympäriltä sekä 10 aminohappoa, jotka yhdistävät GyrA:n viimeiset jäännökset β-piikkipyörään. Sekundäärirakenne-ennusteen perusteella osa linkkeristä rakennettiin alfa-kierteeksi (kuva 3). Seuraava atomimalli, joka sisälsi ATPaasidomeenin, DNA:ta sitovan/purkavan domeenin ja yhden β-pinwheelin, sovitettiin jäykkärunkoisesti kokonaiskompleksirakenteeseen, joka ratkaistiin 6,6 Å:n etäisyydellä Chimeran avulla. Sitten ensimmäisen β-pinwheelin kopio sovitettiin toisen β-pinwheelin tiheyteen COOT-ohjelmalla. Toisen β-pinwheelin ympäriltä puuttuvat nukleiinihapot sekä linkkerin puuttuvat 10 jäämää rakennettiin manuaalisesti COOTissa. Tuloksena syntyneestä atomimallista poistettiin kaikki ionit ja vesimolekyylit, kaikki miehitykset asetettiin arvoon 1 ja B-faktorit arvoon 50. Lopuksi atomiselle mallille tehtiin PHENIX-ohjelmassa reaaliavaruuden hienosäätö kokonaiskompleksirakennetta vasten käyttäen jäykän kappaleen ja globaalin gradienttiohjatun minimoinnin hienosäätöä. Tarkennuksen resoluutioraja asetettiin kultaisen standardin FSC-0.143-kriteerin57 mukaisesti. Lisäksi suoritettiin puolikarttojen ristiinvalidoinnit (täydentävä kuva 4e). Hienosäätöparametrit, mallitilastot ja validointipisteet on esitetty tiivistetysti lisätaulukossa 2. Kokonaisrakenteen atomimalli on talletettu Protein Data Bankiin liittymisnumerolla 6RKW. Kaikki kuvat on luotu Chimera61-, ChimeraX65- ja PyMol-ohjelmilla (Schrodinger L.L.C.).
E. coli GyrB R286K:n, R286Q:n ja E264A:n puhdistus
Muunnettu pET28b, jota käytettiin villiintyneen tyypin E. coli GyrB:n yliekspressiota varten käytettiin, mutatoitiin paikkaohjatulla mutageneesillä käyttäen QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kittiä (Agilent) kolmen R286K-, R286Q- tai E264A-mutaatioita sisältävän plasmidin tuottamiseksi (lisätaulukko 4). Näiden kolmen mutantin yliekspressio- ja puhdistusmenettelyt ovat identtiset villityyppisen GyrB:n kanssa, jotka on kuvattu edellä kohdassa Menetelmät.
T. thermophilus GyrB K284R, K284Q puhdistus
Villityyppisen T. thermophilus GyrB K284R, K284Q puhdistus
Villityyppisen T. thermophilus GyrB:n yliekspressiota12 varten käytettiin, mutatoitiin paikkaohjatulla mutageneesillä käyttäen QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kittiä (Agilent) kahden K284R- tai K284Q-mutaatioita sisältävän plasmidin tuottamiseksi (lisätaulukko 4). Molempien mutanttien yliekspressio- ja puhdistusmenettelyt ovat identtiset edellä kohdassa Menetelmät kuvatun villityyppisen E. coli GyrB:n kanssa.
DNA:n superkäämitysmääritys
Nousevaa DNA-gyraasikonsentraatiota (GyrA2B2) inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa 6 nM:n relaksoidun pUC19-plasmidin kanssa reaktioseoksessa, joka sisälsi 20 mM tris-asetaattia pH 7,9, 100 mM kaliumasetaattia, 10 mM magnesiumasetaattia, 1 mM DTT:tä, 1 mM ATP:tä ja 100 µg/ml BSA:ta. Reaktiot pysäytettiin 30 minuutin kuluttua lisäämällä 1 % SDS:ää. Agaroosigeelielektroforeesilla seurattiin rennon pUC19:n muuttumista superkierteiseen muotoon. Näytteet ajettiin 0,8 % agaroosilla, 1X Tris Borate EDTA puskurissa (TBE) geelillä 6 V/cm:n jännitteellä 180 minuutin ajan huoneenlämmössä. Agaroosigeelit värjättiin 0,5 mg/ml etidiumbromidilla 1X TBE:ssä 15 minuutin ajan, minkä jälkeen ne värjättiin 5 minuutin ajan vedessä. DNA-topoisomeerit paljastettiin Typhoonilla (GE Healthcare).
ATPaasiaktiivisuusmääritys
ATP-hydrolyysi mitataan seuraamalla pyruvaattikinaasin (PK) ja laktaattidehydrogenaasin (LDH) välittämää NADH:n hapettumista. Absorbanssia seurattiin 340 nm:ssä 600 sekunnin ajan 37 °C:ssa Shimadzu 1700 -spektrofotometrillä. Reaktiot rekisteröitiin kolmena kappaleena 50-100 nM GyrA2B2:lla ja 16 nM lineaarisella DNA:lla (pCR-blunt) 500 µl:ssa puskuria, joka sisälsi 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM kaliumasetaattia, 8 mM magnesiumasetaattia, 7 mM BME:tä, 100 µg/mg BSA:ta, 4U/5U PK/LDH-seosta, 2 mM PEP:tä ja 0,5 µg/mg BSA:ta.2 mM NADH.
Multiple alignment and evolutionary conservation of residues
GyrB ATPase/Transducer protein sequences from 30 species (Uniprot codes: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens; Q83FD5_COXBU, Coxiella burnetii; GYRB_ECOLI, Escherichia coli; GYRB_NEIGO, Neisseria gonorrhoeae; GYRB_SALTY, Salmonella typhimurium; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa; Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile; GYRB_RICFE, Rickettsia felis; Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis; GYRB_BORBU; Borrelia burgdorferi; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis, GYRB_THEMA, Thermotoga maritima; GYRB_THET8, Thermus thermophilus; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) linjattiin käyttäen Clustal Omega -palvelinta (EMBL-EBI). Tämän jälkeen tehtyä linjausta käytettiin aminohappojen evolutiivisen säilymisen kuvaamiseen ATPase/transducer-rakenteeseen (PDB ID 1EI1) ConSurf-palvelimen (http://consurf.tau.ac.il) avulla. Fylogeneettinen puu luotiin naapuriliitosmenetelmällä käyttäen moninkertaista kohdistusta Clustal Omega -ohjelmassa.
Raportointiyhteenveto
Lisätietoa tutkimussuunnitelmasta on saatavilla tähän artikkeliin linkitetyssä Nature Research Reporting Summary -julkaisussa.