Tutkimuskohteet
Tässä tutkimuksessa oli mukana 88 hoitoa saanutta LC-potilasta, joilla ei ollut etäpesäkkeitä. Kaikilla potilailla oli diagnosoitu kurkunpään levyepiteelisyöpä patologisen näytetutkimuksen perusteella, ja heitä oli hoidettu Ryukyus-yliopiston korva-, pään- ja kaulakirurgian osastolla tammikuun 2008 ja joulukuun 2017 välillä. Potilaiden lopullinen ennuste arvioitiin heinäkuussa 2018. Kasvain, solmu, etäpesäke (TNM) -vaiheen luokittelu suoritettiin AJCC Staging Manualin (7. painos) mukaisesti. Kliinisen vaiheen määrittämiseksi ja samanaikaisten useiden primaaristen syöpien havaitsemiseksi potilaille tehtiin ruoansulatuskanavan yläosan fyysiset ja endoskooppiset tutkimukset, kaulan ultraäänitarkastus, tietokonetomografia (TT) ja 18F-fluoridodeksiglukoosi-positroniemissiotomografiakuvantaminen.
Tämä tutkimus hyväksyttiin Ryukyus-yliopiston institutionaalisessa arviointilautakunnassa, ja se tehtiin vuonna 1975 annetun Helsingin julistuksen, sellaisena kuin se on tarkistettuna vuonna 2008, mukaisesti. Kaikilta LC-potilailta saatiin tietoinen suostumus ennen tutkimukseen osallistumista.
Hoito
Primäärimuutoksen pääasiallinen hoito kuratiivisessa tarkoituksessa oli tavanomainen pelkkä sädehoito (RT) tai laserresektio T1:ssä, samanaikainen sytostaattisädehoito (CCRT) T2:ssä, CCRT tai leikkaus T3:ssa ja leikkaus T4:ssä HPV:n esiintymisestä riippumatta. Solmukkeelliset leesiot hoidettiin CCRT:llä tai kaulan poistolla, johon yhdistettiin primaarileesion resektio. Kaikille potilaille, jotka saivat sädehoitoa (kokonaisannos 70 Gy), tehtiin CT-avusteinen kolmiulotteinen sädehoidon suunnittelu hoitoasennossa maski-immobilisaatiolla. CCRT-käytäntö oli aiemmin raportoidun mukainen. Kun primaarikasvain T3:ssa ei osoittanut osittaista vastetta kaulan imusolmukevasteesta riippumatta 39,6 Gy:n säteilytyksellä, potilaille tehtiin primaarileesion kuratiivinen leikkaus yhdistettynä kaulan poistoon.
HPV-statuksen toteaminen ja p16-immunohistokemia
Kaikki kudosnäytteet primaarileesioista, joissa ei ollut sädehoitoa tai kemoterapiaa, analysoitiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) HPV-DNA:n toteamiseksi tuoreista jäädytetyistä näytteistä, jotka saatiin koepalojen oton tai kirurgisen resektion yhteydessä, ja p16-immunohistokemian avulla, kun käytettiin FFPE-testin näytteitä. Tapaukset, joissa HPV:n osoitustulos oli negatiivinen PCR:llä ja p16:n yliekspressio (≥75 % positiivisia soluja ja vähintään kohtalainen värjäytymisen voimakkuus), arvioitiin edelleen HPV-statuksen osalta käyttämällä in situ -hybridisaatiota (ISH), jossa käytettiin HPV-DNA-koettimia (DNA ISH) . Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) viruskuorman ja fyysisen tilan määrittämiseksi, kuten jäljempänä on kuvattu, suoritettiin tapauksissa, joissa oli HPV-16 .
PCR HPV-DNA:n havaitsemiseksi
Lyhyesti sanottuna DNA eristettiin kasvainnäytteistä Gentra Puregene Tissue Kitillä (QIAGEN, Germantown, MD). DNA:n läsnäolo ja eheys varmistettiin kaikissa näytteissä PCR β-globiinigeenin monistuksella käyttäen alukkeita PC04 ja GH20 . Yleisen konsensuksen alukesarjaa GP5+/GP6+ ja MY09/MY11 käytettiin HPV-DNA:n esiintymisen analysointiin PCR:llä (taulukko 1) aiemmin kuvatulla tavalla. Lisäksi GP5+/GP6+- tai MY09/MY11-PCR:n suhteen negatiiviset DNA-näytteet monistettiin uudelleen käyttämällä sisäkkäistä PCR-menetelmää GP5+/GP6+-aloitinparilla. Odotetun kokoiset PCR-tuotteet (GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp) puhdistettiin ja sekvensoitiin suoraan ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzerillä (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekvenssit linjattiin ja niitä verrattiin BLAST-ohjelman avulla GenBank-tietokannassa olevien tunnettujen HPV-tyyppien sekvensseihin.
p16:n immunohistokemia
P16:n immunohistokemia suoritettiin käyttämällä CINTec® p16 Histology Kit -kittiä (MTM Laboratories; Roche Applied Sciences, Penzberg, Saksa) valmistajan protokollan mukaisesti . Immunomerkintä visualisoitiin inkuboimalla 3,3′-diaminobensidiinissä ja värjätyt objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä.
Tässä tutkimuksessa käytetyt p16-immunoreaktiivisuuden pisteytyskriteerit olivat seuraavat: 0, ei värjäytymistä; 1, 1 – < 25 % kasvainsoluista positiivisia p16:lle; 2, 25 – < 50 % positiivisia; 3, 50 – < 75 % positiivisia; 4, ≥75 % positiivisia ja heikko värjäytymisen voimakkuus; ja 5, ≥75 % positiivisia ja vähintään kohtalainen värjäytymisen voimakkuus. Termi ”p16:n yliekspressio” (p16-positiivinen) määriteltiin tässä tutkimuksessa pistemääräksi 5.
ISH HPV:n DNA-koettimilla
Biotinyylityramidipohjainen ISH suoritettiin käyttämällä GenPoint™ HPV:n biotinyloidulla DNA-koettimella ja GenPoint-tyramidisignaalin vahvistusjärjestelmällä biotinyloiduille koettimille valmistajan protokollaa (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) noudattaen. GenPoint HPV -biotinyloitu DNA-koetin reagoi HPV-tyyppien 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 ja 68 kanssa FFPE-näytteiden 4 μm:n paksuisissa leikkeissä. Hybridisoidun koettimen havaitseminen suoritettiin GenPoint-detektiojärjestelmällä valmistajan protokollan mukaisesti, johon sisältyi ensisijainen streptavidiini-meripihkaperoksidaasi (HRP), biotinyylityramidi, toissijainen streptavidiini-HRP ja 3,3′-diaminobentsidiini l (Dako; Agilent Technologies). Objektiolevyt vastavärjättiin hematoksyliinillä.
HPV-16:n viruskuorman ja fysikaalisen statuksen arviointi qPCR:llä
HPV-16:n viruskuorman ja fysikaalisen statuksen arvioimiseksi qPCR suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla . Lyhyesti sanottuna käytettiin HPV-16:n E2- ja E6-avoimiin lukukehyksiin kohdistuvia alukkeita ja TaqMan-koettimia (taulukko 1). Alukkeet ja koettimet tunnistavat E2:n sarana-alueen, joka on poistettu HPV-16:n integroitumisen yhteydessä. Kaksi standardikäyrää E2- ja E6-geeneille luotiin monistamalla 10-kertaisia sarjalaimennoksia (101, 102, 103, 104, 105 ja 106 viruskopiota) pB-actin early -plasmidista, joka oli lahja Karl Mungerilta ja joka sisältää täydellisen HPV-16:n varhaisen geenialueen (Addgene-plasmidi # 13711; Addgene, Cambridge, MA). Viruksen DNA-kuorma arvioitiin laskemalla E6-kopioluku. Ulkoinen standardikäyrä luotiin käyttämällä tunnettuja sarjalaimennoksia (0,3, 3, 30 ja 300 ng) ihmisen genomista istukan DNA:ta (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Saksa) solujen DNA:n kvantifiointia varten, ja β-globiini monistettiin aiemmin kuvatulla tavalla. DNA:n määrä laskettiin kuvaamalla Cq-arvot standardikäyrän logaritmia vastaan. HPV-16:n fyysinen status arvioitiin aiemmin julkaistun menetelmän perusteella . E2/E6-suhde ≥ 1 osoittaa episomaalisen muodon vallitsevuutta, kun taas E2-kopiomäärän suhde E6:n kokonaismäärään < 1 osoittaa sekä integroidun että episomaalisen muodon esiintymistä (sekamuoto).
E6:n mRNA:n ilmentymisen toteaminen qPCR:llä ja RNA ISH:lla HPV-16-positiivisilla potilailla, joilla on p16:n yliekspressio
E6:n mRNA:n ilmentyminen havaittiin näytteissä, jotka otettiin potilailta, joilla oli tunnistetusti todettu olevan p16:n yliekspressio ja joilla oli todettu olevan p16 yliekspressio. Kokonais-RNA uutettiin jäädytetyistä kudoksista RNAiso Plus -menetelmällä (Takara Bio, Kusatu, Japani) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA:ta (500 ng) käytettiin ensimmäisen säikeen cDNA:n syntetisointiin PrimeScript™ RT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time; Takara Bio) -reagenssilla valmistajan ohjeiden mukaisesti. HPV-16 E6 mRNA:n ilmentymisen mittaamiseksi suoritettiin qPCR käyttäen CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System -järjestelmää (Bio-Rad, Hercules, CA) ja TaqMan PCR Master Mix II:ta (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Käytettiin alukkeita ja TaqMan-koettimia (taulukko 1), jotka kohdistuvat HPV-16 E6-geeniin ja β-aktiinigeeniin . β-aktiini-koetin oli merkitty FAM:llä 5′-päässä ja TAMRA:lla 3′-päässä (Applied Biosystems Japan, Tokio, Japani). Monistusolosuhteet olivat seuraavat: 2 minuuttia 50 °C:ssa, 10 minuuttia 95 °C:ssa ja kaksivaiheinen sykli 95 °C:ssa 15 sekunnin ajan ja 60 °C:ssa 60 sekunnin ajan, yhteensä 40 sykliä. Kaksi standardikäyrää luotiin E6- ja β-aktiini-geeneille monistamalla 10-kertaisia sarjalaimennoksia (101, 102, 103, 104, 105 ja 106 kopiota) pB-actin early -plasmidista ja pCAG-mGFP-actin-plasmidista, joka oli lahja Ryohei Yasudalta ja joka sisältää β-aktiinin täydellisen koodaavan alueen (Addgene-plasmidi # 21948; Addgene). E6-geenin ilmentyminen kussakin näytteessä normalisoitiin sisäisen kontrollin β-aktiinin määrällä.
RNA ISH HPV-16/- 18 E6/E7 mRNA:lle suoritettiin käyttämällä RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit -reagenssisarjaa (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna FFPE-näytteiden 4 μm:n paksuiset sarjapoikkileikkeet deparafinoitiin ksyleenissä ja rehydratoitiin käyttäen porrastettua alkoholisarjaa. Endogeeninen peroksidaasi estettiin RNAscope® Hydrogen Peroxide Reagentilla huoneenlämmössä 10 minuutin ajan. Kohde-HPV:n RNA:n talteenotto suoritettiin RNAscope® Target Retrieval Reagent -reagenssilla 100 °C:ssa 15 minuutin ajan. Objektiolevyjä digestoitiin RNAscope® Protease Plus -ohjelmalla 40 °C:ssa 30 minuutin ajan. HPV-16/- 18 E6/E7 RNA-koetin (RNAscope® Probe-HPV16/18) lisättiin leikkeisiin ja asetettiin peitinlippa. Objektiolevyt siirrettiin kostutettuun kammioon hybridisointia varten 40 °C:ssa 2 tunnin ajan. Tämän jälkeen peitinliuskat poistettiin ja objektilasit pestiin RNAscope® Wash Buffer Reagentilla 40 °C:ssa. Signaalin monistaminen suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Hybridisoituneen koettimen osoittaminen suoritettiin 3,3′-diaminobensidiinillä (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit). Objektiolevyt vastavärjättiin hematoksyliinillä. Positiiviset kontrollilasit (HPV-18 E6/E7 mRNA:ta ilmentävät HeLa-solut) otettiin mukaan RNA ISH:hen. Positiivinen värjäytyminen tunnistettiin ruskeiksi pistemäisiksi pisteiksi, jotka näkyivät ytimessä ja/tai sytoplasmassa.
Statistinen analyysi
Pearsonin khiin neliö -testiä käytettiin LC-potilaiden ominaisuuksien vertailemiseen HPV-DNA:n ja p16:n yliekspressiotilanteen mukaan. Kumulatiivinen elossaoloaika (CS) laskettiin Kaplan-Meierin menetelmällä ja sitä verrattiin kahden ryhmän välillä log-rank-testillä. Kaikki analyysit tehtiin SPSS-tilastopaketilla (SPSS, versio 25.0; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). P < 0,05 katsottiin merkitseväksi.