APL on tarjonnut natiivigeelianalyysipalveluja vuodesta 1998. Nykyään monet laboratoriot jättävät valitettavasti tämän arvokkaan työkalun huomiotta, koska ne luulevat, että natiivigeelit ovat liian vaikeita käyttää, tai koska ne luulevat virheellisesti, että niitä voidaan käyttää vain happamien proteiinien kanssa. Alliance Protein Laboratories käyttää rutiininomaisesti natiivigeelejä sekä emäksisille että happamille proteiineille. Ajamme mielellämme näytteitä puolestasi ja/tai kehitämme yhdessä kanssasi protokollan käytettäväksi laboratoriossasi.
Mikä on natiivigeeli?
”Natiivigeeli” tai ”ei-denaturoiva” geelielektroforeesi ajetaan ilman SDS:ää. Kun SDS-PAGE:ssa proteiinien elektroforeettinen liikkuvuus riippuu ensisijaisesti niiden molekyylimassasta, natiivissa PAGE:ssa liikkuvuus riippuu sekä proteiinin varauksesta että sen hydrodynaamisesta koosta.
Elektroforeesia ohjaava sähkövaraus määräytyy proteiinille ominaisen varauksen mukaan juoksutuspuskurin pH:ssa. Tämä varaus riippuu luonnollisesti proteiinin aminohappokoostumuksesta sekä translaation jälkeisistä modifikaatioista, kuten sialiinihappojen lisäämisestä.
Koska proteiini säilyttää taitetun konformaationsa, sen hydrodynaaminen koko ja liikkuvuus geelillä vaihtelevat myös tämän konformaation luonteen mukaan (suurempi liikkuvuus kompakteimmille konformaatioille, pienempi suuremmille rakenteille, kuten oligomeereille). Jos natiivi PAGE suoritetaan lähellä neutraalia pH:ta happaman tai emäksisen denaturoinnin välttämiseksi, sitä voidaan käyttää konformaation, itseassosiaatioiden tai aggregaatioiden sekä muiden proteiinien tai yhdisteiden sitoutumisen tutkimiseen.
Siten natiivigeelit voivat olla herkkiä kaikille prosesseille, jotka muuttavat joko proteiinin varausta tai konformaatiota. Tämä tekee niistä erinomaisia välineitä esimerkiksi seuraavien asioiden havaitsemiseen:
-
kemiallisesta hajoamisesta johtuvat varauksen muutokset (esim. deamidoituminen)
-
taiton, ”sulan pallon” tai muut muunnetut konformaatiot
-
oligomeerit ja aggregaatit (sekä kovalenttiset että ei-kovalenttiset)
-
sitoutumistapahtumat (proteiini-proteiini tai proteiini-ligandi)
Tämä ominaisuudet, ja niiden suhteellisen suuri läpäisykyky tekevät natiivigeeleistä erinomaisia välineitä nopeutetun stabiilisuuden näytteiden analysointiin, eri erien tai prosessien vertailukelpoisuuden osoittamiseen tai apuaineiden vaikutusten tutkimiseen.
Natiivigeelien etuna on myös se, että erottelun jälkeen proteiinit on mahdollista ottaa talteen natiivitilassaan. Aktiivisten biologisten materiaalien talteenotto voi kuitenkin olla tarpeen tehdä ennen kiinnittämistä tai värjäystä.
Huomaa, että tässä käsiteltäviä natiivigeelejä kutsutaan nyt joskus ”kirkkaiksi natiivigeeleiksi”. Ne eroavat periaatteessa niin sanotuista ”sinisistä natiivigeeleistä”, jotka riippuvat siitä, että väriaineen sitoutuminen antaa proteiinille hyvin suuren sähköisen varauksen, joka ylittää polypeptidin luontaisen varauksen. Jos oletetaan, että sitoutuneen väriaineen määrä on verrannollinen proteiinin massaan, voidaan tämän ”sinisen natiivin” protokollan avulla havaittua liikkuvuutta käyttää molaarisen massan arvioimiseen vertaamalla sitä proteiinistandardeihin samaan tapaan kuin SDS-PAGE:ssa. Massastandardeja, joita myydään käytettäväksi sinisten natiivigeelien kanssa, ei voida käyttää molaaristen massojen arvioimiseen tässä käsiteltävillä todellisilla natiivigeeleillä.