COMMENTARY
Väriaineen poissulkeminen on yksinkertainen ja nopea tekniikka, jolla mitataan solujen elinkelpoisuutta, mutta siihen liittyy ongelma, että elinkelpoisuus määritetään epäsuorasti solukalvon eheydestä. Näin ollen on mahdollista, että solun elinkelpoisuus on heikentynyt (mitattuna kasvu- tai toimintakyvyllä), vaikka sen kalvon eheys on (ainakin väliaikaisesti) säilynyt. Vastaavasti solukalvon eheys voi olla epänormaali, mutta solu voi silti pystyä korjaamaan itsensä ja tulla täysin elinkelpoiseksi. Toinen mahdollinen ongelma on se, että koska väriaineen imeytymistä arvioidaan subjektiivisesti, pienet määrät väriaineen imeytymistä, jotka viittaavat soluvaurioon, voivat jäädä huomaamatta. Tältä osin fluoresoivalla väriaineella fluoresenssimikroskoopilla suoritettu väriaineen poissulkeminen johtaa rutiininomaisesti useampien elinkelvottomien solujen pisteyttämiseen väriaineen ottamisen avulla kuin trypaninsinisellä läpivalaisumikroskoopilla suoritetut testit.
Kehittyneempi menetelmä solujen elinkelpoisuuden mittaamiseksi on väriaineen poissulkemisen määrittäminen virtaussytometrian avulla. Tämä voidaan tehdä käyttämällä trypaninsinistä, koska tämä proteiini sitoutuu proteiineihin ja lähettää sitten fluoresenssisignaalin, joka voidaan havaita virtaussytometrillä (660 nm:ssä, kun se on sitoutunut naudan seerumin albumiiniin) (ks. viitteestä 2 lisätietoja trypaninsinisen käytöstä virtaussytometriassa). Vaihtoehtoisesti poissulkemista voidaan mitata muilla valoa säteilevillä väriaineilla, kuten propidiumjodidilla (ks. yksikkö 5.4, jossa kuvataan propridiumjodidin käyttöä solujen elinkelpoisuuden arvioimiseksi virtaussytometrisellä analyysillä). Yksityiskohtainen vertailu elävien ja kuolleiden solujen arvioinnista trypaninsinisen poissulkemisen avulla manuaalisesti arvioituna, kuten tässä on kuvattu, ja sähköisesti virtaussytometrisesti arvioituna osoittaa, että nämä kaksi tekniikkaa antavat hyvin samanlaisia tuloksia kokeneissa käsissä. Siinä missä kuvattu väriaineen poissulkemistekniikka johtaa todennäköisemmin virheisiin käyttäjän subjektiivisuuden vuoksi, virtaussytometrinen lähestymistapa ei sovellu yhtä hyvin solujen elinkelpoisuuden arviointiin monimutkaisten ja aikaa vievien solunpuhdistustekniikoiden suorittamisen aikana. Näin ollen virtaussytometrinen tekniikka soveltuu vain silloin, kun on saatava tarkkoja mittauksia kuolleiden solujen määrästä soluseoksessa.
Viime aikoina on raportoitu ”automatisoidusta fluoresenssimikroskoopin elinkelpoisuustestistä”, jossa solujen elinkelpoisuutta mitataan propidiumjodidia käyttäen yhdessä laitteen kanssa, joka laskee elävät ja kuolleet solut kannettavassa mikroskoopin solulaskurissa, joka on varustettu mikrosirulla. Tämän laskurin sanotaan kykenevän arvioimaan solujen elinkelpoisuutta nopeammin kuin tässä kuvatun manuaalisen tekniikan tai virtaussytometrin avulla ja saavuttavan tarkemmat ja luotettavammat luvut. Tämä laite voi olla hyödyllinen tilanteissa, joissa tarvitaan monia nopeasti hankittavia solujen elinkelpoisuuden määrityksiä (3).
On huomattava, että solujen elinkelpoisuutta voidaan arvioida myös DNA:han sitoutuvilla väriaineilla (etidiummonoatsidi), fosfatidyyliseriiniin sitoutuvilla aineilla (Annexin V) ja amiinireaktiivisilla väriaineilla. Näiden vaihtoehtoisten aineiden käyttö edellyttää yleensä virtaussytometriaa ja on siksi sovellettavissa vain tietyissä olosuhteissa.
Trypansinisen poissulkeminen, kuten yllä olevassa protokollassa on kuvattu, voidaan suorittaa 5-10 minuutissa.