Tapauksen esittely
Tämä tapausselostus on peräisin rutiinikäynnistä eläinlääkärin suorittamasta rutiinikäynnistä 155 eläintä käsittävällä tilalla, jossa on kaksi lammasrotua (Pelifolk ja Blackbelly) ja joka sijaitsee Tesistánissa, Zapopanin kunnassa Jaliscon osavaltiossa, Meksikossa. Tilan tilat on mukautettu aiemmasta sikatilasta, ja lähiympäristössä on edelleen sika- ja nautakarjatiloja. Karjaa pidettiin korotetuilla lattioilla puhdistuksen ja käsittelyn helpottamiseksi, mutta karsinoissa oli kuitenkin paljon paahdettuja teräviä esineitä (kuten rautalankaa, rikkinäisiä aitoja, nauloja jne.), eikä puhdistusta suoritettu tilalla tarkastushetkellä asianmukaisesti. Ruokinta perustui paikallisesti saatavilla oleviin rehuihin, kuten heikkolaatuiseen karkearehuun, sianlantaa sisältävään säilörehuun ja runsaasti proteiinia sisältävään kaupalliseen väkirehuun. Tämä tila soitti eläinlääkärille, koska eläimillä havaittiin usein ihopaiseita, mutta muita iho-ongelmiin liittyviä valituksia ei raportoitu. Paiseet eivät näyttäneet vaikuttavan eläinten tuottavuuteen, mutta tällaisten vaurioiden esiintyminen vaikuttaa kielteisesti eläinten markkinointiin, ja siksi omistaja oli kiinnostunut selvittämään taudin aiheuttajan ja suositeltavan hoidon taudin poistamiseksi tilalta. Sertifioitu eläinlääkäri otti näytteet 31 eläimestä (29 uuhta, 1 pässi ja 1 karitsa) ja lähetti ne laboratorioon bakteriologista diagnoosia varten ongelman aiheuttavien etiologisten tekijöiden löytämiseksi. Paiseiden ulkonäön perusteella tilan oletettu infektiodiagnoosi oli useimmilla eläimillä kaseoottinen lymfadeniitti . Bakteriologinen analyysi osoitti kuitenkin, että 13 eläintä oli saanut tartunnan C. pseudotuberculosis -bakteerista, 1 Corynebacterium spp. -bakteerista, 2 Proteus spp. -bakteerista, 2 Streptococcus spp. -bakteerista ja lopuissa 13 tapauksessa taudinaiheuttajaa ei voitu tunnistaa. Corynebacterium spp. -isolaatin luokittelu jäi epäselväksi, koska bakteriologisten ja biokemiallisten testien tulokset eivät olleet päätelmällisiä.
Tässä artikkelissa kuvataan C. xerosis -bakteerin eristäminen 4 kuukauden ikäisestä, hyvässä ruumiinkunnossa olleesta Pelifolk-karitsasta (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk). Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen raportti C. xerosis -bakteerista, joka aiheuttaa kliinisen ihopaisuman lampaalla. Eläimen omistajalta saatiin tietoinen suostumus kliinisen tutkimuksen tulosten julkaisemiseen, valokuvamateriaali mukaan luettuna. Eläimellä oli kaulan vasemmalla puolella kovan koostumuksen omaava paise, joka ei valunut ulos (kuva 1a). Alkuperäinen kliininen diagnoosi viittasi kaseoottiseen lymfadeniittiin, jonka mahdollisesti aiheutti C.pseudotuberculosis. Näyte bakteriologista analyysia varten otettiin punkteeraamalla paise steriilillä 5 ml:n ruiskulla 20 mm:n injektioneulalla sen jälkeen, kun paise oli puhdistettu ja desinfioitu. Kerätty erite oli seroosin kaltaista ja valkoista. Biologinen näyte säilytettiin 4 °C:ssa, kunnes sen biologinen karakterisointi suoritettiin Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal -laitoksessa (CIESA, km 15,5 Toluca-Atlacomulco road, Toluca, Meksiko, z.c. 50200). Näytteenoton ja käsittelyn välinen aika oli enintään 72 tuntia. Näyte viljeltiin kahtena kappaleena 8-prosenttisessa lampaanveriagarissa ja inkuboitiin 24-48 tuntia 37 °C:ssa aerobisissa ja mikroaerofiilisissä olosuhteissa. Havaittiin halkaisijaltaan 1,0 mm:n kokoisia pesäkkeitä, jotka eivät olleet hemolyyttisiä, väriltään kellertävän ruskeita ja ulkonäöltään hieman kuivia (kuva 2a). Nämä morfologiset ominaisuudet eivät vastanneet aiemmin C. pseudotuberculosis -bakteerille kuvattuja ominaisuuksia, vaan ne näyttivät pikemminkin C. xerosis -bakteerin pesäkkeiltä. Mikroskooppisesti (10-kertainen suurennos; kuva 2c) bakteerit havaittiin keppimäisesti päättyneinä, pleomorfisina, epäsäännöllisesti värjäytyneinä grampositiivisina sauvoina. Biokemialliset testit osoittivat seuraavat tulokset: Kolminkertainen sokeri-rauta (TSI,-), Lysiini-rauta-agar (LIA,-), sitraattitesti (CIT,-), sulfidi-indoli-motiliteetti (SIM,-), motiliteetti, indoli, ornitiini (MIO,-), oksidatiivinen-fermentatiivinen (OF,-) metyylipunainen (-), Peptonivesi (-), Voger Pascaguer (-), Urea (-), Nitraattiliemi (+), Trehaloosi (+), Sakkaroosi (+), Maltoosi (+) ja Glukoosikäyminen (positiivinen 37 °C:ssa ja negatiivinen 42 °C:ssa). Nämä tulokset voisivat vastata C. pseudotuberculosis -profiilia, lukuun ottamatta ureatestiä, joka oli negatiivinen eikä positiivinen, joten se sopisi paremmin yhteen C. xerosis -profiilin kanssa. Diagnostiset tulokset eivät olleet vakuuttavia, joten vaikka API-järjestelmä ei ole spesifinen C. xerosis -bakteerin tunnistamiseen, päätimme tutkia isolaattia tällä järjestelmällä selvittääksemme, voitaisiinko tämä isolaatti tunnistaa muuksi Corynebacterium-lajiksi. Lisäksi selvittääksemme, kuuluuko tämä isolaatti muihin lajeihin, kuten C. freneyi ja C. amycolatum, joita esiintyy harvoin lampaissa, testasimme, pystyikö pesäke kasvamaan 20 °C:ssa ja pystyikö se fermentoimaan glukoosia 42 °C:ssa. Isolaatti kasvoi hyvin 20 °C:ssa eikä fermentoinut glukoosia 42 °C:ssa, jotka molemmat ovat C. xerosis- ja C. hansenii -bakteereille ominaisia ominaisuuksia, joten päätimme tehdä molekyylianalyysin selvittääksemme, voimmeko molekyylianalyysin avulla tunnistaa isolaatin C. xerosis -bakteeriksi. Analysoimme kolme lokusta diagnoositarkkuuden lisäämiseksi. Testasimme geenin, joka normaalisti puuttuu C. xerosis -bakteerista, mutta esiintyy C. pseudotuberculosis -bakteerissa, eli pld-geenin, jonka kohdalla odotimme, että PCR-testin jälkeen ei löytyisi amplikonia, jos isolaatti olisi C. xerosis -bakteeri, toisin kuin C. xerosis -bakteeri. pseudotuberculosis, joka monistaa 203 bp:n kaistan; toinen lokus kohdistui 16S-23S rRNA-geenien intergeenisen spacer-alueen (16S-23S) monistamiseen käyttäen C. pseudotuberculosis -geenille suunniteltuja alukkeita, joiden ei ole raportoitu toimivan C. xerosis -geenin kohdalla, ja odottaisimme myös, että C. xerosis -geenin kohdalla ei olisi yhtään amplifikaatiokaistaa, kun taas 816 bp:n kaistaleen odotetaan olevan olemassa, kun kyseessä on C. pseudotuberculosis. Lopuksi suoritimme PCR-monistamisen ja sekvensoinnin rpoB-geenistä (446 bp), jonka on aiemmin raportoitu erottavan Corynebacterium-lajit toisistaan. DNA:n uuttaminen suoritettiin kaupallisella kitillä (KAPA Express Extract) valmistajan protokollan mukaisesti. Multiplex-PCR-tekniikka pld-, 16S-23S- ja rpoB-geenien osasekvenssien monistamiseksi tehtiin Pachecon vuonna 2007 julkaiseman protokollan mukaisesti. Reaktiot tehtiin kaupallisella multipleksi-PCR-pakkauksella (QIAGEN Multiplex PCR) valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR-analyysi käsitti seuraavat näytteet: karakterisoitava isolaatti, oletettavasti C. xerosis -isolaatti ja kaksi C. pseudotuberculosis -lajia (yksi paikallinen isolaatti, joka oli aiemmin karakterisoitu biovar ovis -lajiksi, ja vertailukanta ATCC 43924, biovar equi), joita käytettiin kontrolleina. Kuten oletetulta C. xerosis -bakteerilta odotettiin, PCR:llä monistettiin yksi 446 bp:n amplikonikaista, joka vastaa rpoB-geenifragmenttia, eikä intergeenistä 16S-23S-geeniä ja pld-geenifragmentteja monistettu. Odotetusti molemmissa C. pseudotuberculosis -kannoissa havaittiin myös kolme 203, 446 ja 816 bp:n bändiä, jotka vastasivat vastaavasti geenejä pld, rpoB ja 16S (kuva 3). Kaikkien kolmen näytteen RpoB-geenin amplikonit puhdistettiin Promegan puhdistussarjalla (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) ja lähetettiin Macrogenin (Rockville, MD, USA) automaattiseen sekvensointiin. BLASTin (NCBI) avulla saadut moninkertaiset sekvenssikohdistukset analysoitiin yhdessä isolaattiemme sekvenssien kanssa Mega 6.0.6:n Clustal W -analyysin avulla (kuva 4). Fylogeneettinen analyysi tehtiin käyttämällä naapuriliitosmenetelmää (MEGA-ohjelmisto 6.0.6). Bootstrap-arvot saatiin tuottamalla 1000 satunnaispuuta. Fylogeneettiseen analyysiin sisällytettiin myös C. xerosis -bakteerin (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculosis biovar ovis -bakteerin (GenBank CP002924.1) ja C. pseudotuberculosis biovar equi -bakteerin (GenBank CP003540.2) rpoB-geenin sekvenssit. Oli mahdollista havaita erilaisia fylogeneettisiä ryhmiä, jotka vastasivat tiettyjä Corynebacterium-lajeja. Nämä tulokset, vahvistavat, että tämän tutkimuksen isolaatti (rpoB C53) on C. xerosis (Kuva 4).
Tutkittu paise. Neljän kuukauden ikäisen karitsan kaulan alueella raportoitiin kovakonsistenttinen paise ilman tyhjennystä
Corynebacterium xerosis- ja Corynebacterium pseudotuberculosis -bakteerien bakteeriviljely in vitro. Bakteerit viljeltiin 8-prosenttisella lampaanveriagarilla. aCorynebacterium pseudotuberculosis (ATCC 43924) osoitti valkoisia pesäkkeitä, joissa oli beta-hemolyysi. bCorynebacterium xerosis -isolaatti, kasvoi pieninä kellertävänruskeina pesäkkeinä ilman hemolyysiä. c Corynebacterium xerosis -bakteerin gramvärjätty preparaatti, jossa näkyy tyypillisiä pleomorfisia grampositiivisia sauvoja, joilla on kerhonmuotoiset päät
Multiplex PCR. 16S rRNA-, rpoB- ja pld-geenien osasekvenssien monistaminen. MW-kaista: molekyylipainomarkkeri 1 Kb Plus DNA Ladder™ (Invitrogen). Lane 1: negatiivinen kontrolli (reaktio ilman templaatti-DNA:ta). Kaista 2: Corynebacterium pseudotuberculosis biovar equi. Kaistat 3-4: Corynebacterium xerosis -isolaatti (vastaavasti 10-0,001 ng DNA:ta). Kaista 5: Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis
Bioinformatiikan analyysi. a Osoittaa sekvenssikohdistusta sekvensseistä, joita käytettiin fylogeneettisen puun rakentamiseen kohdassa (b). Kolme sekvenssiä ladattiin GenBankista: C. pseudotuberculosis biovar ovis (CP002924.1), C. pseudotuberculosis biovar equi (CP003540.2) ja Corynebacterium xerosis (AY492233.1). Kolme muuta olivat näytteitä, jotka lähetettiin sekvensoitavaksi (Macrogen, Rockville, MD, USA): rpoB13 (paikallinen isolaatti, joka on luonnehdittu C. pseudotuberculosis, biovar ovis), rpoB C1 (C. C. pseudotuberculosis, biovar equi, vertailukanta ATCC43924) ja rpoB C53 (paikallinen isolaatti, luonnehdittu C. xerosis -lajiksi). b Puu osoittaa Corynebacterium pseudotuberculosis -bakteerin ja Corynebcaterium xerosis -bakteerin geneettiset sukulaisuussuhteet rpoB-geenin osalta. Puu on muodostettu geenin osittaisen sekvenssin linjauksen perusteella. Bootstrap-arvot saatiin generoimalla 1000 satunnaista puuta, ja kunkin oksan vahvuus on merkitty vastaavaan solmuun
Genotyypinmääritystekniikat, kuten PCR, sekä rpoB C53 -isolaatin sekvenssianalyysi tässä tutkimuksessa vaikuttivat suuresti oikeaan lajinmääritykseen, joka alun perin oli harhaanjohtava, kun käytettiin fenotyyppisiä mikroskooppisia ja biokemiallisia ominaisuuksia. Corynebacterium xerosis -bakteeria on aiemmin raportoitu ihmisten kliinisissä näytteissä endokardiitin, keuhkotulehduksen, osteomyeliitin ja ihoinfektioiden vaurioissa, erityisesti immuunipuutteisilla potilailla . Sitä on löydetty myös eläinten kliinisistä näytteistä, esimerkiksi vuohen maksan vaurioista (epäilty pseudotuberkuloosi) ja lehmänmaidosta, joka on peräisin utaretulehdusta sairastavilta eläimiltä. Sialla C. xerosis -bakteeria on eristetty eri kudosten, kuten maksan, munuaisten, keuhkojen, pernan ja nivelten vaurioista sekä ihonalaisista paiseista. Lisäksi C. xerosis -bakteeria on eristetty lampaiden kohdun kliinisistä näytteistä aborttitapauksessa ja keuhkokudoksesta eläimistä, joilla on hengitysvaikeuksia. Nämä isolaatit tunnistettiin ja karakterisoitiin monistamalla rRNA 16S-23S-geeni PCR-RFLP:n avulla. Näissä tutkimuksissa ei kuitenkaan ollut mahdollista saada riittävän selkeää kaistakuviota, jotta C. xerosis olisi voitu erottaa muista Corynebacterium-lajeista. Kirjoittajat tekivät myös 16S- ja rpoB-geenien analyysin ja sekvenssivertailun, jonka avulla he pystyivät erottamaan C. xerosis -lajin muista lajeista, jotka ovat geneettisesti samanlaisia kuin Corynebacterium .
Kuten edellä mainittiin, tämä tutkimus suoritettiin rpoB-geenin perusteella, jonka muut kirjoittajat ovat ilmoittaneet olevan Corynebacterium-suvun fylogeneettiseen analyysiin soveltuva geeni, koska siinä on suurta polymorfismia, jopa suurempaa kuin 16S-23S rRNA-geenien intergeenisellä spacer-alueella . Tiedetään, että lampaiden ihon paiseet (kaseoottinen lymfadeniitti) ovat C. pseudotuberculosis -bakteerin aiheuttamia, ja sen tärkein virulenssi- ja patogeenisuustekijä on pld-geenin koodaama ja bakteerin solukalvolla ilmentyvä eksotoksiini fosfolipaasi D . Tämä eksotoksiini on läpäisevyystekijä, joka edistää nisäkkäiden solukalvojen sfingomyeliinin esterisidosten hydrolyysiä, mikä mahdollisesti edistää bakteerien leviämistä alkuperäiseltä infektiopaikalta toissijaisiin infektiopaikkoihin imusuoniston kautta alueellisiin ganglioihin, ja se näyttää olevan osallisena makrofagien elinkelpoisuuden vähenemisessä infektion jälkeen . Eksotoksiini aiheuttaa myös dermonekroottisia vaurioita . Tätä eksotoksiinia ei kuitenkaan ole raportoitu C. xerosis -bakteerissa patogeenisena toksiinina, joka voisi vaikuttaa paiseiden kehittymiseen. Tämä korostaa, että on tärkeää tehdä lisätutkimuksia tässä Corynebacterium-lajissa esiintyvistä infektiomekanismeista.
Epidemiologista keskustelua herättää muun muassa se, että lampaiden tuotantojärjestelmää, josta näyte otettiin, käytettiin aiemmin sikojen tuotantoon, lajin, jossa C. xerosis on raportoitu yleisenä patogeenina . Lisäksi yksi lampaiden ruokavalion tärkeimmistä ainesosista sisältää sikojen sivutuotteita (sikojen lanta-silavaa), joissa saattaa olla aktiivisia taudinaiheuttajia, ehkä myös Corynebacterium spp. Lisäksi terävät esineet, kuten metallitangot, naulat ja johdot, ovat laajalti levinneet kaikkialle tiloissa, mikä lisää eläinten loukkaantumismahdollisuuksia, mikä avaa mahdollisuuden Corynebacterium spp:n pääsylle elimistöön, mukaan lukien C. xerosis. Kaikki nämä tekijät ovat saattaneet vaikuttaa C. xerosis -bakteerin esiintymiseen laitoksessa. Lisätutkimuksia ei tehty, mutta omistajalle suositeltiin kuitenkin, että hän poistaisi ja desinfioisi paiseet kaikista eläimistä infektioita sisältävällä alueella (taudinaiheuttajien leviämisen välttämiseksi), vahvistaisi karsinoiden puhdistusta ja poistaisi kaikki terävät reunat ja esineet aidoista, ruokintalaitteista ja lattioista. Koska C. xerosis sekä C. pseudotuberculosis ovat potentiaalisia zoonoottisia mikro-organismeja, viljelijälle annettiin suosituksia äärimmäisistä varotoimista eläinten ja tilan tuottamien jätteiden käsittelyssä ihmisten ja eläinten tartuntojen ja mikro-organismin mahdollisen leviämisen estämiseksi muille tiloille.