Yksi lähestymistapa PD:n estämiseksi on PCR-järjestelmän fysikaalis-kemiallinen optimointi eli alukkeiden, magnesiumkloridin, nukleotidien, ionivahvuuden ja reaktion lämpötilan muuttaminen. Tätä menetelmää rajoittavat jonkin verran fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, jotka määräävät myös kohdesekvenssin monistumisen tehokkuuden PCR:ssä. Siksi PD:iden muodostumisen vähentäminen voi johtaa myös PCR:n tehokkuuden vähenemiseen. Tämän rajoituksen voittamiseksi muilla menetelmillä pyritään vähentämään vain PD:iden muodostumista, mukaan lukien alukkeiden suunnittelu ja erilaisten PCR-entsyymijärjestelmien tai reagenssien käyttö.
Alukkeiden suunnitteluohjelmistoEdit
Alukkeiden suunnitteluohjelmisto käyttää algoritmeja, jotka tarkistavat DNA:n sekundäärirakenteiden muodostumisen potentiaalin ja alukkeiden annealingin itseensä tai alukeparien sisällä. Fysikaaliset parametrit, jotka ohjelmisto ottaa huomioon, ovat alukkeiden mahdollinen itsekomplementaarisuus ja GC-pitoisuus, alukkeiden samankaltaiset sulamislämpötilat ja sekundäärirakenteiden, kuten kantasilmukoiden, puuttuminen DNA:n kohdesekvenssistä.
Kuumakäynnistys-PCREdit
Koska alukkeet suunnitellaan siten, että ne ovat vähän komplementaarisia toisiinsa nähden, ne voivat anneerautua toisiinsa nähden (kuvan vaihe I) vain matalissa lämpötiloissa, esimerkiksi huoneenlämpötilassa, esim. reagenssisekvenssin valmistamisen aikana. Vaikka PCR:ssä käytettävät DNA-polymeraasit ovat aktiivisimmillaan noin 70 °C:n lämpötilassa, niillä on jonkin verran polymeroivaa aktiivisuutta myös alhaisemmissa lämpötiloissa, mikä voi aiheuttaa DNA-synteesin alukkeista niiden annealingin jälkeen. On kehitetty useita menetelmiä, joilla estetään PD:iden muodostuminen, kunnes reaktio saavuttaa käyttölämpötilan (60-70 °C), ja näihin menetelmiin kuuluu DNA-polymeraasin alustava estäminen tai reaktiokomponenttien fyysinen erottaminen reaktiosta, kunnes reaktioseos saavuttaa korkeammat lämpötilat. Näitä menetelmiä kutsutaan hot-start PCR:ksi.
Vaha: Tässä menetelmässä entsyymi erotetaan alueellisesti reaktioseoksesta vahalla, joka sulaa, kun reaktio saavuttaa korkean lämpötilan.
Magnesiumin hidas vapautuminen: DNA-polymeraasi tarvitsee magnesiumioneja aktiivisuuteensa, joten magnesium erotetaan kemiallisesti reaktiosta sitoutumalla kemialliseen yhdisteeseen, ja se vapautuu liuokseen vasta korkeassa lämpötilassa
Inhibiittorin ei-kovalenttinen sitoutuminen: Tässä menetelmässä peptidi, vasta-aine tai aptameeri sitoutuvat ei-kovalenttisesti entsyymiin matalassa lämpötilassa ja estävät sen toimintaa. Kun inhibiittoria on inkuboitu 1-5 minuuttia 95 °C:ssa, inhibiittori vapautuu ja reaktio alkaa.
Kylmäherkkä Taq-polymeraasi: on modifioitu DNA-polymeraasi, jolla ei ole juuri lainkaan aktiivisuutta matalassa lämpötilassa.
Kemiallinen modifiointi: Tässä menetelmässä pieni molekyyli sidotaan kovalenttisesti aminohapon sivuketjuun DNA-polymeraasin aktiivisessa kohdassa. Pieni molekyyli vapautuu entsyymistä inkuboimalla reaktioseosta 10-15 minuuttia 95 °C:ssa. Kun pieni molekyyli on vapautunut, entsyymi aktivoituu.
Alukkeiden rakenteelliset modifikaatiot Muokkaa
Toinen lähestymistapa PD:n muodostumisen estämiseksi tai vähentämiseksi on alukkeiden modifiointi siten, että niiden annealoituminen itsensä tai toistensa kanssa ei aiheuta pidennystä.
HANDS-järjestelmä (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System): alukkeen 5′-loppuiseen päähän liitetään alukkeen 3′-loppuiseen päätyyn komplementaarinen nukleotidinen häntä. Koska 5′ pyrstö on lähellä, se kiinnittyy alukkeen 3′ päähän. Tuloksena on stem-loop-alkuaine, joka estää lyhyempiä päällekkäisyyksiä sisältävän annealingin, mutta sallii alukkeen annealingin täysin komplementaariseen sekvenssiinsä kohteessa.
Kimeeriset alukkeet: Jotkin DNA:n emäkset alukkeessa korvataan RNA:n emäksillä, jolloin syntyy kimeerinen sekvenssi. Kimeerisen sekvenssin sulamislämpötila toisen kimeerisen sekvenssin kanssa on alhaisempi kuin kimeerisen sekvenssin DNA:n kanssa. Tämä ero mahdollistaa annealing-lämpötilan asettamisen siten, että alukkeen annealing tapahtuu sen kohdesekvenssiin, mutta ei muihin kimeerisiin alukkeisiin.
Blokkautuneet-poistuvat alukkeet: Menetelmässä, joka tunnetaan nimellä RNaasi H-riippuvainen PCR (rhPCR), käytetään termostabiilia RNaasi HII:tä poistamaan estoryhmä PCR:n alukkeista korkeassa lämpötilassa. Tällä RNaasi HII -entsyymillä ei ole juuri lainkaan aktiivisuutta matalassa lämpötilassa, joten estoryhmän poistaminen tapahtuu vain korkeassa lämpötilassa. Entsyymillä on myös luontainen alukkeen ja templaatin epäsuhtaisuuden erottelukyky, mikä johtaa lisäselektioon alukedimeerejä vastaan.
Alukedimeereistä aiheutuvan signaalin saannin estäminen Muokkaa
Vaikka edellä esitetyt menetelmät on suunniteltu vähentämään PD:n muodostumista, eräällä toisella lähestymistavalla pyritään minimoimaan määrällisessä PCR:ssä PD:stä syntyvä signaali. Tämä lähestymistapa on käyttökelpoinen niin kauan kuin PD:tä muodostuu vähän ja niiden estävä vaikutus tuotteen kertymiseen on vähäinen.
Nelivaiheinen PCR: Käytetään, kun työskennellään epäspesifisillä väriaineilla, kuten SYBR Green I:llä. Se perustuu PD:iden ja kohdesekvenssin eripituisuuteen ja siten erilaiseen sulamislämpötilaan. Tässä menetelmässä signaali saadaan kohdesekvenssin sulamislämpötilan alapuolelta, mutta PD:n sulamislämpötilan yläpuolelta.
Sekvenssispesifiset koettimet: TaqMan- ja molekyylimajakka-koettimet tuottavat signaalin vain kohdesekvenssin (komplementaarisen) läsnä ollessa, ja tämä parannettu spesifisyys estää PD:iden signaalin saamisen (mutta ei mahdollisia inhiboivia vaikutuksia tuotteen kertymiseen).