Site-Directed Mutagenesis Tips and Tricks

Site-directed mutagenesis (SDM) on tekniikka, jota käytetään yhden tai useamman emäksen muuntamiseen plasmidissa. Tällä menetelmällä voidaan muuttaa aminohappokoostumusta, tuhota transkriptiotekijöiden sitoutumiskohtia tai luoda fuusioproteiineja – vain muutamia esimerkkejä mainitakseni.

Vaikka SDM:ää käytetään yleisimmin nukleiinihappojen ja proteiinien rakenteen ja biologisen aktiivisuuden tutkimiseen, se on hyödyllinen myös rajoitusentsyymien tunnistuskohtien lisäämiseksi tai poistamiseksi kloonauksen avuksi.

SDM:ää voidaan lisäksi käyttää hyödyllisenä koodonien optimointityökaluna harvinaisten koodonien korvaamiseksi ilmentymisvektoreissa, jotta voidaan parantaa heterologisten proteiinien ilmentymisen tehokkuutta. Tämä on joskus tarpeen, koska koodonibias on ilmiö, jossa organismit suosivat tiettyjä koodoneja toisten kustannuksella riippuen tRNA:n saatavuudesta solussa. Voit lukea lisää codonin käytöstä ja codon biasista täältä.

Kun SDM:ää käytetään koodaavan sekvenssin muuttamiseen, sillä luodaan spesifisiä mutanttikonstruktioita, joista puuttuu kriittisiä jäännöksiä tai proteiinidomeeneja, jotka osallistuvat posttranslationaalisiin modifikaatioihin tai proteiinin vakauden säätelyyn. Kriittisten jäännösten tai alueiden, kuten fosforylaatiokohtien tai kriittisten domeenien, poistaminen plasmideistasi on yksi tapa osoittaa tiettyjen proteiinien ominaisuuksien merkitys. Esimerkiksi fosforylaatiokohtien, kuten seriinin muuttaminen reagoimattomaksi alaniiniksi tai fosfomimeeteiksi, kuten asparagiinihapoksi, antaa luotettavaa näyttöä proteiinien kohdekohtaisesta fosforylaatiosta. Sen avulla voidaan tutkia tällaisten posttranslationaalisten modifikaatioiden in vitro -vaikutuksia.

Traditionaaliset lähestymistavat paikkaohjattuun mutageneesiin

Käänteinen PCR

Käänteinen PCR on suosituin lähestymistapa >50 bp:n deletioihin tai insertioihin. Käänteisessä PCR:ssä käytetään peräkkäisiä alukkeita koko plasmidin monistamiseen, minkä jälkeen lineaarinen tuote ligoidaan muodostaen pyöreää DNA:ta. Tämä tekniikka soveltuu myös suurempiin insertioihin tai deleetioihin, esimerkiksi säätelydomainin poistamiseen proteiinista.

Deleetioita varten valittu alue voidaan poistaa suunnittelemalla alukkeita, jotka anlyysoituvat kohdennetun deleetioalueen kummallekin puolelle. Amplifikaatio etenee tästä alueesta ulospäin, jolloin tämä alue jää pois PCR-tuotteesta. Kun lineaarinen tuote on ligatoitu, uudesta konstruktiosta puuttuu tämä deleetioalue. Tämä prosessi on esitetty kaavamaisesti alla olevassa kuvassa 1.

Kuva 1. Käänteisen PCR:n protokolla SDM:ssä.

Insertiot voidaan saada aikaan käyttämällä päällekkäisiä alukkeita, joiden flanking-sekvenssit sisältävät sopivia ylimääräisiä emäksiä. Lisätietoa käänteisestä PCR:stä löytyy seuraavista lähteistä:

• Ochman et al. (1998) Genetic Applications of an Inverse Polymerase Chain Reaction. Genetics. 120:621-623.
• Clifford N. Dominy ja David W. Andrews. Site-Directed Mutagenesis by Inverse PCR.

SDM käyttäen modifioituja alukkeita

Tässä tekniikassa käytetään modifioituja alukkeita pienten emäsparimuutosten sisällyttämiseksi plasmidiin, ja se on valittu menetelmä paikkaspesifisiin mutaatioihin. Aluksi sinun on suunniteltava joitakin alukkeita. Mutta ennen kuin aloitat:

• Tulosta kopio aminohappokodonitaulukosta
• Hae plasmidisi tai proteiinisekvenssi valmiiksi.
• Varmista, että tiedät, missä aloituskodoni on ja missä lukukehyksessä sekvenssi luetaan.

Alukkeiden suunnittelu

Tarkoita noin 30 bp:n pituisia SDM-alkukkeita, joissa mutaatiokohtasi on mahdollisimman lähellä keskustaa. Vaikka on hyväksyttävää tehdä alukkeista hieman pidempiä tai lyhyempiä tarpeen mukaan, mutaatiokohdan molemmin puolin tulisi olla vähintään 12 bp.

Jos tarvitset apua alukkeiden suunnittelussa, http://molbiol-tools.ca/PCR.htm luettelee joitakin todella hyödyllisiä resursseja, jotka auttavat sinua eteenpäin.

Valitse oikeat reagenssit

Ordinaarinen Taq-polymeraasi ei riitä SDM-menetelmään – tarvitset oikaisuentsyymin. Kaupallisesti on saatavilla erilaisia polymeraasipaketteja, jotka soveltuvat tähän tehtävään ja joissa on useita ominaisuuksia, kuten korkea uskollisuus (oikolukukyky) ja hot start -aktivointi. Yksi mahdollisuus on Takaran In-Fusion HD Cloning Plus – all in 1 -ratkaisu, joka sisältää korkean uskollisuuden polymeraasin, PCR-puhdistussarjan, kloonausentsyymin ja päteviä soluja paikkaohjattua mutageneesiä varten.

Muista, että kuten useimmilla laboratorioreagensseilla, myös monilla polymeraaseilla on omat hyvät ja huonot puolensa – yleensä laboratorioilla on historiallisia syitä, joiden vuoksi ne ovat valinneet yhden polymeraasin toisen sijaan. Vaikka on järkevää pitäytyä siinä, mikä toimii, ei ole haittaa lukea kirjallisuutta muista saatavilla olevista resursseista varmistaaksesi, että sinulla on parhaat reagenssit työhön!

PCR-reaktio

Käytettävät PCR-olosuhteet vaihtelevat kitin ja polymeraasin valinnan sekä suunnittelemiesi alukkeiden ja tuotteen koon mukaan. Alla oleva esimerkki on kuitenkin hyvä lähtökohta.

Vaihe	Lämpötila (°C)	Aika (s)	Syklit
Denaturointi	94	15	18
Anneal	60	30	18
Extension	72	20/kb plasmidi	18

TAULUKKO 1: Esimerkki SDM:n lämpökierto-ohjelmasta

Syklien määrän pitäminen alhaisena estää ei-toivottujen mutaatioiden syntymisen. Kahdeksantoista syklin pitäisi tuottaa kohtuullinen määrä mutatoitunutta tuotetta ilman ei-toivottujen mutaatioiden sisällyttämistä. Huomaa, että syklien lukumäärää voidaan tarvittaessa muuttaa vianmäärityksen aikana.

Digest It!

Nyt kun PCR-tuotteesi on valmis, älä unohda kriittistä vaihetta – digestointia! Tässä vaiheessa sulatat vanhemman templaatti-DNA:n varmistaaksesi, että sinulla on vain mutatoitunut plasmidi bakteeritransformaatiota varten. Vakioprotokollien mukaan endonukleaasi Dpn1:n kanssa on inkuboitava 1 tunti 37 °C:ssa, jotta kaikki dam-metyloitunut ja hemi-metyloitunut parentaalinen DNA saadaan sulatettua, jolloin jäljelle jää haluttu mutatoitunut plasmidi.

Transformointi ja sekvensointi

Transformoi plasmidisi kompetentteihin soluihin aivan kuten minkä tahansa muun ekspressioplasmidin kohdalla ja eristä yksittäisiä pesäkkeitä plasmidin eristämistä varten.

Nyt sinulla pitäisi olla pieni määrä haluamaasi plasmidia. Ennen kuin aloitat kokeilut, lähetä näyte sekvensointia varten, jotta voit varmistaa haluamasi modifikaation (modifikaatioiden) läsnäolon. Yhtä tärkeää on varmistaa, ettei sekundaarisia ei-toivottuja mutaatioita ole.

Jos sekvensointi antaa positiivisen tuloksen – onnittelut, olet SDM-ammattilainen! Mutta jos sekvensointi antaa negatiivisen tuloksen – älä hermostu! Voit aina yrittää uudelleen – asiantuntijavinkkimme SDM:n vianmääritykseen pitäisi saada sinut takaisin oikeille raiteille!

Tänä päivänä oligonukleotidisynteesin alenevat kustannukset ja synteettisen biologian edistysaskeleet merkitsevät sitä, että synteettiset lähestymistavat ovat yleistymässä paikkaohjatun mutageneesin sijaan. Lisäksi CRISPR/Cas9-teknologian kehittyminen on myös yksinkertaistanut geenieditointia siten, että mutageneesi voidaan nyt suorittaa in vitro ja in vivo muutamassa yksinkertaisessa vaiheessa. SDM on kuitenkin edelleen molekyylibiologian työkalupakin peruspilari, eikä se ole lähiaikoina menossa minnekään.

Originally published in 2016. Päivitetty ja uudelleen julkaistu vuonna 2018.