Transwell-migraatiomääritys on klassinen tekniikka, jonka avulla tutkijat voivat kvantifioida solujen liikkumista. Migraatiolla tarkoitetaan solun kykyä liikkua yksittäin tai ryhmissä. Solujen liikkeet mahdollistetaan niiden sytoskeletin tarkalla uudelleenjärjestelyllä, ja migraatio tapahtuu yleensä vastauksena ärsykkeisiin, jotka toimivat vihjeinä.
Tänään keskustelemme transwellin migraatiomäärityksestä, jossa hyödynnetään yksinkertaista kammioasetelmaa migraation arvioimiseksi vastauksena houkutteleviin vihjeisiin.
Aloitamme antamalla hieman taustatietoa transwell-kammiosta.
Laitteen suunnitteli ensimmäisen kerran tohtori Stephen Boyden vuonna 1961, joka käytti sitä leukosyyttien migraation tutkimiseen. Siksi menetelmä tunnetaan myös nimellä Boydenin kammiokoe.
Yksinkertaisessa Boydenin kammiossa ulkoseinä on kuoppia, kuten 96-kuoppalevyssä. Kunkin kuopan sisälle asetetaan transwell, joka on lieriömäinen insertti. Insertissä on polykarbonaattikalvo, jonka huokoskoko on määritelty. Kun se asetetaan kuoppaan, se jakaa kammion kahteen osastoon. Ylempään lokeroon kylvetään soluja, joiden vaelluskäyttäytymistä halutaan tutkia, ja alempaan lokeroon sijoitetaan kemoattraktoriliuos. Määritelmän mukaan kemoattraktantti on molekyyli, jolla on kyky edistää solujen liikkuvuutta ”vetämällä soluja puoleensa”.
Tämän vetovoiman ansiosta yläosastossa olevat solut vaeltavat huokosten läpi pohjasäiliöön. Jos soluilla on tarttuvia ominaisuuksia, kuten joillakin melanoomasoluilla, ne liikkumisen jälkeen ”tarttuvat” kalvon alapuolelle. Tällöin kalvo voidaan kiinnittää, värjätä ja laskea solut mikroskoopilla. Toisaalta ei-kiinnittyvät solut, kuten siittiöt, vaeltavat pohjasäiliöön. Tällöin säiliöliuoksessa olevat solut voidaan laskea hemosytometrin avulla.
Vaikka tämän kokeen asetukset ovat yksinkertaiset, on useita asioita, jotka sinun on otettava huomioon ennen koetta. Käydään läpi joitakin niistä.
Alkaen kylvöliuoksesta, sinun on varmistettava, että tiheys on optimoitu solujen migraation havainnoimiseksi. Liian harvat solut voivat johtaa havaitsemattomaan migraatioon, ja suuremmat tiheydet ylikansoittavat kalvon, mikä vaikeuttaa migraation luettelemista. Toinen näkökohta on insertin huokoskoko. Se on valittava huolellisesti solutyypin mukaan. Jos huokoskoko on liian pieni, solut eivät pääse läpi.
Vaihtoehtoisesti, jos huokoskoko on liian suuri, solut vain putoavat läpi, mikä ei ole migraatiota. Lopuksi on otettava huomioon kemoattraktiivisen aineen pitoisuus ja migraatiolle annettava inkubaatioaika, sillä ne ovat riippuvaisia toisistaan. Optimaalinen konsentraatio ja sopiva inkubaatioaika, jonka aikana konsentraatiogradientti säilyy lokeroiden välillä, saavat aikaan solujen migraation kemoattraktiosta johtuen. Sitä vastoin pitkittyneisiin inkubaatioihin voi liittyä kemoattraktantin tasaantuminen koko kammiossa, mikä johtaa kemiallisen gradientin häviämiseen, mikä voi sekoittaa saatujen tulosten analysoinnin.
Keskustellaanpa näiden näkökohtien pohjalta protokollaa, jota käytetään adherenttien solujen migraation mittaamiseen.
Määritettävät solut valmistetaan proteaasivapaassa elatusaineessa, koska proteaasit voivat denaturoida tärkeät membraanireseptorit ja viime kädessä vaikuttaa migraatioon. Kun solut on valmistettu, suspensio on laimennettava optimaaliseen kylvötiheyteen. Kammion valmistelemiseksi transwell-solut sijoitetaan monikuoppalevyn kuoppiin. Solususpensio on pipetoitava transwell-kammioon koskematta kalvoon tai ilman ilmakuplia.
Khemoattraktioliuos pipetoidaan alempaan säiliöön varmistaen, että liuos koskettaa insertin kalvoa. Migraation inkubaatioaika riippuu kokeellisista näkökohdista. Inkuboinnin jälkeen kalvot kiinnitetään kastamalla insertti 70-prosenttiseen etanoliin. Kun insertin annetaan kuivua, lisätään soluvärjäysliuos.
Seuraavaksi soluja inkuboidaan noin 30 minuuttia huoneenlämmössä. Inkuboinnin jälkeen insertit pestään pesupuskurin avulla. Lopuksi kalvo voidaan irrottaa ja asettaa mikroskooppilasille. Kalvon alapuolella olevat solut edustavat niiden solujen lukumäärää, jotka ovat vaeltaneet kemoattraktanttien läsnä ollessa ja ilman niitä.
Koska nyt tunnet protokollan, tarkastellaan lyhyesti, miten tutkijat käyttävät tätä menetelmää tutkimuksissaan.
Yksi tämän määrityksen yleisimmistä sovelluksista on tuntemattomien yhdisteiden kemoattraktiivisten ominaisuuksien arviointi. Tässä tapauksessa tutkijat olivat kiinnostuneita tutkimaan sammakon siittiöiden uintimatkoja alluriinin läsnä ollessa, joka on sammakkoeläinten munien erittämä aine. Tätä varten he pipetoivat ensin aktiivisia sammakon siittiöitä transwell-inserttien yläosaan. Pohjalle he lisäsivät alluriinia. Kun solujen oli annettu vaeltaa, he laskivat mikroskoopilla siittiöitä säiliöliuoksessa. Tämän tekniikan avulla he pystyivät luomaan pitoisuus-vastekäyrän, joka kuvaa alluriinipitoisuuden vaikutusta siittiöiden migraatioon.
Kun patogeenit hyökkäävät solun kimppuun, se lähettää kemoattraktantteja rekrytoidakseen immuunisoluja, jotka vaeltavat, kiinnittyvät ja sen jälkeen poistavat infektion. Tämän ilmiön testaamiseksi nämä tutkijat viljelivät epiteelisoluja inserttien alapuolella. Tämän jälkeen he tartuttivat nämä solut eri bakteerikannoilla. Lopuksi he siirsivät immuunisoluja yläkammioon. Tiedetään, että infektoituneet solut tuottavat useita kemoattraktantteja, jotka indusoivat immuunisolujen siirtymistä. Tämän kokeen tulokset osoittivat, että neutrofiilien migraatio on eriasteista vastauksena erityyppisiin bakteeri-infektioihin.
Viimeiseksi, syöpäsolujen invaasio ja metastaasi solunulkoisen matriisin kautta on aina kiehtonut solubiologeja. Tässä tutkijat halusivat selvittää, miten tietyt kemoattraktantit voivat edistää tällaista migraatiota 3D-matriisin läpi. He loivat geneettisesti kaksi erillistä solupoolia: toinen ilmentää vihreää fluoresoivaa ja toinen punaista fluoresoivaa proteiinia. Sitten he pipetoivat solunulkoista matriisia jäljittelevää ainetta transwellin yläosaan.
Kun se oli jähmettynyt, he käänsivät transwellin ylösalaisin ja kylvivät kaksi solupoolia kalvon alapuolelle. Seuraavaksi he asettivat insertin takaisin monikuoppalevyyn ja pipetoivat kemoattraktoriliuoksen yläkammioon. Tämä sai alhaalla olevat solut liikkumaan ylöspäin ja 3D-matriisin läpi. Konfokaalikuvantamisen avulla nämä tutkijat rekonstruoivat solujen migraation 3D:ssä ja erottivat kahden soluryhmän migraatiomallit.
Olet juuri katsonut JoVE:n videon transwellin migraatiomäärityksestä. Kun ymmärrät tämän menetelmän komponentit ja protokollan, tiedät nyt, miksi solubiologit käyttävät sitä niin paljon. Huolimatta tämän asetelman yksinkertaisuudesta, konfiguraatioiden valikoima, johon tällä menetelmällä voidaan mukautua, tekee siitä korvaamattoman solujen liikkuvuustutkimuksissa. Kuten aina, kiitos katselusta!