Biologiset näkökohdat
Zymogeenien aktivoituminen tapahtuu rajoitetulla intra- tai intermolekulaarisella proteolyysillä, joka pilkkoo inhiboivan propeptidin . Proseptit ovat tärkeitä proteaasiaktiivisuuden modulaattoreita, jotka takaavat, että kypsä entsyymi muodostuu oikeassa paikassa ja/tai oikeaan aikaan . Joidenkin C1A-peptidaasien jäsenten synteesissä on C-terminaalinen ER-pidätyssignaali KDEL, joka kohdistaa nämä proteaasit erikoistuneisiin lytisiin vesikkeleihin. KDEL-sekvenssi näyttää toimivan sekä kohdistusdomeenina että inaktiivisen muodon säilyttämisessä . Lisäksi kasvien granuliineihin, joita pidetään papaiiniperheen alaluokkana ja jotka osallistuvat myös senesenssiin, kuuluu C-terminaalinen jatkosekvenssi, jossa on Pro-rikas alue ja granuliinidomeeni, joka on hyvin homologinen epiteliini-/granuliiniperheen eläinproteaasien kanssa . Tämä granuliinin kaltainen domeeni voi myös osallistua proteaasin liukoisuuden säätelyyn ja sen aktivoitumiseen .
C1A-peptidaasien aktiivisuus riippuu myös pH:sta, mikä viittaa lokalisaatiokompartimenttiin, johon ne lokalisoituvat, ja endogeenisten proteaasin säätelijöiden läsnäoloon. Solujen sisällä tapahtuva lokeroituminen tarjoaa uuden säätelytason, jolloin kasvisolut sisältävät useita erityyppisiä organelleja, joilla kullakin on erikoistunut tehtävä. Inaktiiviset pro-entsyymit syntetisoidaan endoplasmisen retikulumin (ER) luumenissa. Sen jälkeen ne kuljetetaan trans-Golgi-verkon kautta vakuoleihin tai erittyvät ulkoisesti, jotta ne saavuttavat hajotettavan kohdeproteiinin. Lisäksi on raportoitu KDEL-häntäisten C1A-peptidaasien proformien massakuljetusta proteiinivarastojen vakuoleihin ER:stä peräisin olevien vesikkelien välityksellä mobilisaatiossa kaksisirkkaisten itävien siementen siemenissä . Vakuolien suhteellisen hapan pH tarjoaa optimaaliset olosuhteet proteaasien prosessoinnille, sillä nämä organellit eivät ole ainoastaan entsyymien toimintapaikka vaan myös niiden aktivointipaikka. Lisäksi C1A-peptidaasit varastoidaan yleensä tai syntetisoidaan uudelleen yhdessä solutyypissä, jotta ne voivat aloittaa kohdeproteiinien hajoamisen muissa solutyypeissä. Esimerkkinä voidaan mainita, että useat ohran katekpsiini L-, H- ja B:n kaltaiset proteaasit ovat läsnä skutellar-epiteelissä ja aleuronikerroksessa, ja ne erittyvät sitten endospermiin itämisen yhteydessä vastauksena GA:n vaikutukseen.
Kasvien C1A-peptidaaseja koskevat viimeaikaiset tutkimukset ovat koskeneet enimmäkseen analyysejä, joissa on analysoitu geenejä monien kasvi- ja vihanneslajien genomien sekvensoinnin perusteella. Aminohapposekvenssianalyysien ja uusien proteaasijäsenten tunnistamisen lisäksi on tehtävä lisää tutkimusta proteiinitasolla, jotta näiden entsyymien fysiologisia rooleja voidaan selvittää tarkemmin. Yksittäisten Cys-proteaasien osallistumisesta proteiinien hajoamiseen senesenssi- ja abskissioprosessien, ohjelmoidun solukuoleman, hedelmien kypsymisen sekä varastoproteiinien kertymisen ja mobilisoinnin aikana siemenissä ja mukuloissa on julkaistu . C1A-proteaaseilla on myös olennainen rooli paikallisissa ja systeemisissä puolustusreaktioissa patogeenejä ja tuholaisia vastaan .
Siemenet toimivat itämisprosessin aikana tärkkelyksen, proteiinien ja lipidien varastoina, joita käytetään itämisen aikana siihen asti, kunnes fotosynteesi on täysin vakiintunut. Varastojen hydrolyysi on avainasemassa, ja sen suorittavat pääasiassa amylaasit ja proteaasit, jotka joko varastoituvat siementen kypsymisen aikana tai syntetisoituvat uudelleen varhaisen itämisen aikana. Hajoamistuotteet imeytyvät ja hyödynnetään taimien kehityksessä. C1A-peptidaasit on kuvattu runsaimmaksi proteaasiryhmäksi, joka vastaa varastoproteiinien hajoamisesta ja mobilisoinnista yksisirkkaisten ja kaksisirkkaisten lajien siemenissä . Suurin osa siementen itämistä koskevasta tutkimuksesta on tehty viljakasveilla, erityisesti ohralla, jossa suurin osa analysoiduista tapahtumista on keskittynyt transkriptiotasolle. Useita transkriptiotekijöitä koodaavien geenien monimutkainen verkosto on kuvattu geeneiksi, jotka osallistuvat hydrolaasi-ekspression hallintaan itämisen alussa . Lisäksi C1A-proteaasiaktiivisuutta näyttävät säätelevän posttranslationaalisella tasolla legumaiinit, Asn-spesifiset kysteiinipeptidaasit, jotka osallistuvat polypeptidien prosessointiin ja proteiinien hajoamiseen . Zhang & Jones raportoi, että 27 kysteiiniproteaasia oli niiden 42 proteaasin joukossa, jotka osallistuvat ohran siementen itämiseen. Hiljattain ohran jyvien itämisen täydellinen transkriptomianalyysi kahdessa kudosfraktiossa (tärkkelyspitoinen endospermi/aleuroni ja alkio/scutellum) osoitti, että itämisen aikana indusoituu suuri määrä C1A-peptidaasigeenejä, joista suurin osa on gibberelliinien välittämiä . Lisäksi useiden ohran katekpsiini L:n kaltaisten peptidaasien, jotka ilmentyvät eri tavoin siemenkudoksissa, on todettu osallistuvan ohran tärkeimpien varastoproteiinien, hordeinien, mobilisointiin. Vastaavasti vehnän C1A-proteaaseja koodaavat ortologiset geenit osallistuvat vehnän endospermin massaproteiinien hajoamiseen siementen itämisen ja sen jälkeisen taimikasvun aikana .
Myös kaksisirkkaisten siementen varastoitujen yhdisteiden mobilisoinnista vastaavat pääasiassa C1A-peptidaasit, vaikka niiden ilmentymis- ja aktiivisuusmallit ja -aktiivisuudet eroavat huomattavasti yksisirkkaisista. Palkokasvien ja rypsin siemenissä globuliinit ovat jyvän runsaimpia varastoproteiineja, ja ne mobilisoituvat ensimmäisen kerran alkion akselissa itämisen aikana. Vasta kun akselin proteiinivarastot ovat ehtyneet, suurin osa globuliineista mobilisoituu itämisen jälkeen sikiöihin. Muut kysteiinipeptidaasit, kuten legumaiinit, näyttävät olevan välttämättömiä endoproteolyyttisessä pilkkomisessa varastoproteiinien mobilisoinnissa alkion akselissa ja sikiöissä eri palkokasvilajeissa . Legumainien rooli on osoitettu myös virnan ja tattarin sytyledonien 11S-globuliinien laskeutumis- ja mobilisoitumistapahtumissa siementen itämisen aikana . Hiljattain Wang et al. ovat osoittaneet, että legumaiinit ovat myös välttämättömiä entsyymejä riisin gluteliinien kypsymisessä, jotka muodostavat jopa 80 % riisin endospermin kokonaisproteiineista.
Senessanssi on tiukasti kontrolloitu prosessi koko kasvin kehityksen ajan, jota endogeeniset ja eksogeeniset tekijät ja stressitekijät voivat moduloida . Se on ominaista kudoksen organisaation purkamiselle ja erittäin tehokkaalle ravinteiden mobilisoinnille ja siirtämiselle vanhoista lehdistä, terälehdistä ja muista elimistä nielukudoksiin (mukulat, viljakasvien siemenet, hedelmät) jatkuvan kasvun ja kehityksen ylläpitämiseksi. On kuvattu useita C1A-peptidaaseja, jotka osallistuvat senesenssiin eri kudoksissa ja lajeissa: Dianthus caryophyllus L.:n ja Alstroemerian terälehdet , vehnän ja Arabidopsiksen lehdet , appelsiinin kuoren kuoriutuminen jne. Risiinipavun, päivänliljan ja mungopavun vanhenevissa kudoksissa KDEL-häntäinen propeptidaasi on pääkomponentti ER:stä nuppuuntuvan erityisen organellin (ricinosomi tai prekursoriproteaasivesikkeli) matriksissa. On oletettu, että näistä organelleista vapautuvan peptidaasin kertymistä tarvitaan senesenssin viimeisimmissä vaiheissa . Lisäksi proteaasi Cyp15a:n (joka luokitellaan katekpsiini F:n kaltaiseksi peptidaasiksi) anti-sense-vaimennus johti Medicago truncatulassa viivästyneisiin senesenssi-ilmiöihin . Siirtogeeniset tupakkakasvit, jotka ilmentävät riisikystatiini OC-I:tä, joka on kysteiinipeptidaasin estäjä, kasvoivat hitaammin kuin kontrollit ja osoittivat muutoksia lehtien proteiinipitoisuudessa, jossa muun muassa kahden Rubisco-aktivaasi-isomuodon runsaus lisääntyi, sekä viivästynyttä vanhenemista . Näin ollen näiden kirjoittajien mukaan Rubisco on todennäköisesti kysteiinipeptidaasien pääkohde senesenssin aikana ja vuorovaikutusmekanismit Rubiscoa sisältävien vesikkelien vacuolaarisen hajoamisen kautta. Samoin kysteiinipeptidaasien kertymistä senesenssiin liittyviin vakuoleihin, joilla on intensiivinen proteolyyttinen aktiivisuus, on havaittu vanhenevissa Arabidopsis-soijan ja tupakan lehdissä. Samanaikaisesti todettiin Rubisco-tasojen tasainen lasku, mikä viittaa näiden proteaasien rooliin klorofyllin hajoamisessa senesenssin aikana. Lisäksi havainnot papaiinin kaltaisten peptidaasien esiasteista yhdessä pro-legumainien kanssa Arabidopsiksen epidermissolujen proteaasilajittelevissa ER-ruumiissa viittaavat siihen, että kumpikin kysteiiniproteaasityyppi myötävaikuttaa yhteistyössä stressireaktioihin, kuten ne myötävaikuttavat varastoproteiinien mobilisaatioon siementen itämisen aikana .
C1A-peptidaaseilla on myös ratkaiseva merkitys kasvipatogeenien ja tuholaisten vuorovaikutuksessa . Useat raportit ovat osoittaneet, että kasvit käyttävät C1A-peptidaaseja suojautuakseen eri tuholaisilta. Papaiini on papaijan lateksin komponentti, joka osallistuu papaijapuun puolustautumiseen erilaisia lepidopteran toukkia vastaan . Mir1 on maissista peräisin oleva C1A-proteaasi, joka indusoituu vastauksena kasvinsyöjämato Spodoptera frugiperda -kasvintuhoojan torjuntaan. Nautittuaan Mir1:n proteolyyttinen aktiivisuus vahingoittaa hyönteisen peritrofista matriisia heikentäen ravinteiden hyväksikäyttöä . Samoin C1A-proteaaseja käytetään puolustautumisprosesseissa kasvipatogeeneja vastaan. Arabidopsiksen katepsiini B -geenit osallistuvat hypersensitiiviseen vasteeseen, ja niitä tarvitaan täydelliseen peruskestävyyteen virulenttia bakteeripatogeeniä Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 vastaan. Kahden toisiinsa liittymättömän eukaryoottisen kasvipatogeenin, sieni Cladosporium fulvum ja oomycete Phytophthora infestans, erittämät apoplastiset efektorit kohdistuvat tomaatin puolustuksen C1A Cys -peptidaasi Rcr3:een. Nämä efektorit ovat kystatiinin kaltaisia kysteiiniproteaasi-inhibiittoreita, mikä tukee sitä tärkeää roolia, joka C1A-entsyymien ja fytokystatiinien välisellä vuorovaikutuksella on kasvien puolustuksessa.