APL propose des services d’analyse sur gel natif depuis 1998. Aujourd’hui, de nombreux laboratoires ignorent malheureusement cet outil précieux parce qu’ils pensent que les gels natifs sont tout simplement trop difficiles à utiliser, ou parce qu’ils croient à tort qu’ils ne peuvent être utilisés qu’avec des protéines acides. Chez Alliance Protein Laboratories, nous effectuons régulièrement des gels natifs sur des protéines basiques et acides. Nous serions heureux d’exécuter des échantillons pour vous et/ou de travailler avec vous pour développer un protocole à utiliser dans votre laboratoire.
Qu’est-ce qu’un gel natif ?
L’électrophorèse sur gel « native » ou « non dénaturante » est exécutée en l’absence de SDS. Alors qu’en SDS-PAGE, la mobilité électrophorétique des protéines dépend principalement de leur masse moléculaire, en PAGE native, la mobilité dépend à la fois de la charge de la protéine et de sa taille hydrodynamique.
La charge électrique qui conduit l’électrophorèse est régie par la charge intrinsèque de la protéine au pH du tampon de fonctionnement. Cette charge dépendra, bien sûr, de la composition en acides aminés de la protéine ainsi que des modifications post-traductionnelles telles que l’ajout d’acides sialiques.
Puisque la protéine conserve sa conformation repliée, sa taille hydrodynamique et sa mobilité sur le gel varient également avec la nature de cette conformation (mobilité plus élevée pour les conformations plus compactes, plus faible pour les structures plus grandes comme les oligomères). Si la PAGE native est réalisée à proximité d’un pH neutre pour éviter la dénaturation acide ou alcaline, alors elle peut être utilisée pour étudier la conformation, l’auto-association ou l’agrégation, et la liaison d’autres protéines ou composés.
Les gels natifs peuvent donc être sensibles à tout processus qui modifie soit la charge, soit la conformation d’une protéine. Cela en fait d’excellents outils pour détecter des choses telles que :
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les changements de charge dus à la dégradation chimique (par ex. désamidation)
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conformations non repliées, « globule fondu », ou autres conformations modifiées
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oligomères et agrégats (covalents et non covalents)
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événements de liaison (protéine-protéine ou protéine-ligand)
Ces propriétés, et leur débit relativement élevé, font des gels natifs d’excellents outils pour analyser des échantillons de stabilité accélérée, démontrer la comparabilité de différents lots ou processus, ou examiner les effets des excipients.
Un autre avantage des gels natifs est qu’il est possible de récupérer les protéines dans leur état natif après la séparation. La récupération des matériaux biologiques actifs peut cependant devoir être effectuée avant toute fixation ou coloration.
Notez que les gels natifs dont il est question ici sont maintenant parfois appelés gels « natifs clairs ». Ils diffèrent en principe des gels dits « natifs bleus », qui dépendent de la liaison d’un colorant pour donner à la protéine une charge électrique très élevée, dépassant la charge intrinsèque du polypeptide. Si la quantité de colorant liée est supposée être proportionnelle à la masse de la protéine, alors la mobilité observée à l’aide de ce protocole « blue native » peut être utilisée pour estimer la masse molaire en la comparant à des standards protéiques, comme cela est fait pour la SDS-PAGE. Les standards de masse vendus pour être utilisés avec les gels natifs bleus ne peuvent pas être utilisés pour estimer les masses molaires des véritables gels natifs dont il est question ici.