Une approche pour prévenir les DP consiste à optimiser physico-chimiquement le système PCR, c’est-à-dire à modifier les concentrations d’amorces, de chlorure de magnésium, de nucléotides, la force ionique et la température de la réaction. Cette méthode est quelque peu limitée par les caractéristiques physico-chimiques qui déterminent également l’efficacité de l’amplification de la séquence cible dans la PCR. Par conséquent, la réduction de la formation des PD peut également entraîner une réduction de l’efficacité de la PCR. Pour surmonter cette limitation, d’autres méthodes visent à réduire la formation de PD uniquement, y compris la conception d’amorces, et l’utilisation de différents systèmes d’enzymes PCR ou de réactifs.
Logiciels de conception d’amorcesEdit
Les logiciels de conception d’amorces utilisent des algorithmes qui vérifient le potentiel de formation de structures secondaires de l’ADN et l’annelage des amorces à lui-même ou au sein des paires d’amorces. Les paramètres physiques qui sont pris en compte par le logiciel sont l’auto-complémentarité potentielle et la teneur en GC des amorces ; les températures de fusion similaires des amorces ; et l’absence de structures secondaires, telles que les boucles tiges, dans la séquence cible de l’ADN.
Démarrage à chaud PCREdit
Parce que les amorces sont conçues pour avoir une faible complémentarité entre elles, elles peuvent s’anneler (étape I dans la figure) uniquement à basse température, par exemple à température ambiante, comme pendant la préparation du mélange réactionnel. Bien que les ADN polymérases utilisées dans la PCR soient le plus actives autour de 70 °C, elles ont une certaine activité de polymérisation également à des températures plus basses, ce qui peut provoquer la synthèse d’ADN à partir des amorces après leur annelage l’une à l’autre. Plusieurs méthodes ont été développées pour empêcher la formation de PD jusqu’à ce que la réaction atteigne la température de travail (60-70 °C), et celles-ci comprennent l’inhibition initiale de l’ADN polymérase, ou la séparation physique des composants de la réaction jusqu’à ce que le mélange réactionnel atteigne les températures plus élevées. Ces méthodes sont appelées PCR à démarrage à chaud.
Cire : dans cette méthode, l’enzyme est séparée spatialement du mélange réactionnel par de la cire qui fond lorsque la réaction atteint une température élevée.
Lente libération de magnésium : L’ADN polymérase a besoin d’ions magnésium pour son activité, le magnésium est donc séparé chimiquement de la réaction en se liant à un composé chimique, et n’est libéré dans la solution qu’à haute température
La liaison non covalente de l’inhibiteur : dans cette méthode, un peptide, un anticorps ou un aptamère sont liés de manière non covalente à l’enzyme à basse température et inhibent son activité. Après une incubation de 1 à 5 minutes à 95 °C, l’inhibiteur est libéré et la réaction commence.
Polymérase Taq sensible au froid : c’est une ADN polymérase modifiée dont l’activité est presque nulle à basse température.
Modification chimique : dans cette méthode, une petite molécule est liée de manière covalente à la chaîne latérale d’un acide aminé dans le site actif de l’ADN polymérase. La petite molécule est libérée de l’enzyme par incubation du mélange réactionnel pendant 10 à 15 minutes à 95 °C. Une fois la petite molécule libérée, l’enzyme est activée.
Modifications structurelles des amorcesEdit
Une autre approche pour prévenir ou réduire la formation de DP consiste à modifier les amorces de sorte que l’annelage avec elles-mêmes ou entre elles ne provoque pas d’extension.
HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System) : une queue nucléotidique, complémentaire de l’extrémité 3′ de l’amorce est ajoutée à l’extrémité 5′ de l’amorce. En raison de la proximité de la queue 5′, elle s’annule à l’extrémité 3′ de l’amorce. Le résultat est une amorce en forme de tige-boucle qui exclut le recuit impliquant des chevauchements plus courts, mais permet le recuit de l’amorce à sa séquence entièrement complémentaire dans la cible.
Amorce chimérique : certaines bases d’ADN dans l’amorce sont remplacées par des bases d’ARN, créant une séquence chimérique. La température de fusion d’une séquence chimérique avec une autre séquence chimérique est inférieure à celle de la séquence chimérique avec l’ADN. Cette différence permet de régler la température d’annelage de telle sorte que l’amorce s’annule à sa séquence cible, mais pas aux autres amorces chimériques.
Amorces clivables bloquées : une méthode connue sous le nom de PCR dépendante de la RNase H (rhPCR), utilise une RNase HII thermostable pour éliminer un groupe bloquant des amorces PCR à haute température. Cette enzyme RNase HII ne présente pratiquement aucune activité à basse température, ce qui fait que la suppression du blocage ne se produit qu’à haute température. L’enzyme possède également une discrimination inhérente des mésappariements amorce:matrice, ce qui entraîne une sélection supplémentaire contre les dimères d’amorce.
Prévenir l’acquisition de signal à partir de dimères d’amorceModifier
Alors que les méthodes ci-dessus sont conçues pour réduire la formation de DP, une autre approche vise à minimiser le signal généré par les DP dans la PCR quantitative. Cette approche est utile tant qu’il y a peu de PD formés et que leur effet inhibiteur sur l’accumulation de produits est mineur.
PCR en quatre étapes : utilisée lorsqu’on travaille avec des colorants non spécifiques, comme le SYBR Green I. Elle est basée sur la longueur différente, et donc, la température de fusion différente des PD et de la séquence cible. Dans cette méthode, le signal est acquis en dessous de la température de fusion de la séquence cible, mais au-dessus de la température de fusion des DP.
Sondes spécifiques à la séquence : Les sondes TaqMan et balises moléculaires génèrent un signal uniquement en présence de leur séquence cible (complémentaire), et cette spécificité accrue exclut l’acquisition du signal (mais pas les éventuels effets inhibiteurs sur l’accumulation du produit) à partir des DP.