Sujets
Cette étude a porté sur 88 patients LC naïfs de traitement et sans métastase à distance. Tous les patients ont été diagnostiqués avec un carcinome épidermoïde laryngé par examen pathologique des échantillons et ont été traités au département d’oto-rhino-laryngologie, chirurgie de la tête et du cou, Université des Ryukyus, entre janvier 2008 et décembre 2017. Le pronostic final des patients a été jugé en juillet 2018. La classification du stade de la tumeur, du ganglion, des métastases (TNM) a été réalisée selon le manuel de stadification de l’AJCC (7e édition). Pour déterminer le stade clinique et détecter les cancers primaires multiples concomitants, les patients ont subi des examens physiques et endoscopiques du tractus gastro-intestinal supérieur, une inspection ultrasonique du cou, une tomodensitométrie (CT) et une imagerie tomographique par émission de positons au 18F-fluorodésoxyglucose.
Cette étude a été approuvée par le conseil d’examen institutionnel de l’Université des Ryukyus et a été réalisée conformément à la Déclaration d’Helsinki de 1975, telle que révisée en 2008. Un consentement éclairé a été obtenu de tous les patients LC avant leur inscription.
Traitement
Le traitement principal de la lésion primaire avec intention curative était la radiothérapie conventionnelle (RT) seule ou la résection au laser en T1, la chimioradiothérapie concomitante (CCRT) en T2, la CCRT ou la chirurgie en T3, et la chirurgie en T4, indépendamment de la présence du HPV. Les lésions nodales ont été traitées par RTCC ou par dissection du cou associée à la résection de la lésion primaire. Tous les patients qui ont reçu une RT (dose totale, 70 Gy) ont bénéficié d’une planification tridimensionnelle de la radiothérapie assistée par scanner en position de traitement avec immobilisation par masque. Le protocole de la RTCC était celui rapporté précédemment. Lorsque la tumeur primaire en T3 n’a pas montré une réponse partielle indépendamment de la réponse des ganglions lymphatiques du cou à une irradiation de 39,6 Gy, les patients ont subi une chirurgie curative de la lésion primaire combinée à une dissection du cou.
Détection du statut HPV et immunohistochimie p16
Tous les échantillons de tissus des lésions primaires sans aucune radiation ou chimiothérapie ont été analysés avec la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour la détection de l’ADN HPV en utilisant des échantillons frais congelés, qui ont été obtenus lors de la biopsie ou de la résection chirurgicale, et l’immunohistochimie p16 en utilisant des échantillons FFPE. Les cas dont les résultats de la PCR étaient négatifs et qui présentaient une surexpression de p16 (≥75 % de cellules positives et une intensité de coloration au moins modérée) ont fait l’objet d’une évaluation supplémentaire du statut HPV par hybridation in situ (ISH) avec des sondes ADN HPV (DNA ISH). Une PCR quantitative en temps réel (qPCR) pour la charge virale et le statut physique, comme décrit ci-dessous, a été réalisée dans les cas hébergeant le HPV-16 .
PCR pour la détection de l’ADN du HPV
En bref, l’ADN a été isolé des échantillons de tumeur à l’aide d’un kit de tissu Gentra Puregene (QIAGEN, Germantown, MD). La présence et l’intégrité de l’ADN ont été vérifiées dans tous les échantillons par amplification PCR du gène de la β-globine en utilisant les amorces PC04 et GH20 . Les ensembles d’amorces de consensus général GP5+/GP6+ et MY09/MY11 ont été utilisés pour analyser la présence de l’ADN du VPH par PCR (tableau 1), comme décrit précédemment. En outre, les échantillons d’ADN négatifs pour la PCR GP5+/GP6+ ou MY09/MY11 ont été réamplifiés par une approche de PCR nichée avec la paire d’amorces GP5+/GP6+. Les produits PCR de la taille attendue (GP5+/GP6+, 150 pb ; MY09/MY11, 450 pb) ont été purifiés et séquencés directement avec un analyseur génétique ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, Foster City, CA). Les séquences ont été alignées et comparées à l’aide du programme BLAST avec celles des types de HPV connus dans la base de données GenBank.
Immunohistochimie de p16
L’immunohistochimie de p16 a été réalisée à l’aide d’un kit histologique CINTec® p16 (MTM Laboratories ; Roche Applied Sciences, Penzberg, Allemagne) conformément au protocole du fabricant . L’immunomarquage a été visualisé par incubation dans la 3,3′-diaminobenzidine et les lames colorées ont été contre-colorées avec de l’hématoxyline.
Les critères de notation de l’immunoréactivité de p16 utilisés dans la présente étude étaient les suivants : 0, aucune coloration ; 1, 1 – < 25% des cellules tumorales positives pour p16 ; 2, 25 – < 50% positives ; 3, 50 – < 75% positives ; 4, ≥75% positives et faible intensité de coloration ; et 5, ≥75% positives et au moins une intensité de coloration modérée. Le terme « surexpression de p16 » (p16-positif) a été défini comme un score de 5 dans la présente étude.
ISH avec des sondes ADN HPV
L’ISH à base de tyramide de biotinyle a été réalisée en utilisant la sonde ADN biotinylée GenPoint™ HPV et le système d’amplification du signal de tyramide GenPoint pour les sondes biotinylées selon le protocole du fabricant (Dako ; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). La sonde ADN biotinylée GenPoint HPV réagit avec les types de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 et 68 dans des sections de 4μm d’épaisseur d’échantillons FFPE. La détection de la sonde hybridée a été réalisée à l’aide du système de détection GenPoint conformément au protocole du fabricant, avec les éléments suivants inclus : streptavidine primaire-peroxydase de raifort (HRP), tyramide biotinylique, streptavidine secondaire-HRP et 3,3′-diaminobenzidine l (Dako ; Agilent Technologies). Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxyline.
Estimation de la charge virale et du statut physique du HPV-16 par qPCR
Pour évaluer la charge virale et le statut physique du HPV-16, la qPCR a été réalisée comme décrit précédemment . En bref, des amorces et des sondes TaqMan ciblant les cadres de lecture ouverts E2 et E6 du HPV-16 ont été utilisées (tableau 1). Les amorces et les sondes reconnaissent la région charnière E2, qui est supprimée lors de l’intégration du HPV-16. Deux courbes standard pour les gènes E2 et E6 ont été créées par amplification de dilutions sérielles de 10 fois (101, 102, 103, 104, 105 et 106 copies virales) du plasmide pB-actin early, un don de Karl Munger, portant la région complète du gène précoce du HPV-16 (Addgene plasmid # 13711 ; Addgene, Cambridge, MA). La charge virale en ADN a été évaluée en calculant le nombre de copies E6. Une courbe standard externe a été créée en utilisant des dilutions en série connues (0,3, 3, 30 et 300 ng) d’ADN placentaire génomique humain (Sigma-Aldrich ; Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) pour la quantification de l’ADN cellulaire, et la β-globine a été amplifiée comme décrit précédemment. La quantité d’ADN a été calculée en reportant les valeurs de Cq en fonction du logarithme de la courbe standard. Le statut physique du HPV-16 a été évalué sur la base d’une méthode publiée précédemment . Un rapport E2/E6 ≥ 1 indique la prédominance de la forme épisomique, tandis qu’un rapport nombre de copies E2/total E6 < 1 indique la présence de formes intégrées et épisomiques (forme mixte).
Détection de l’expression de l’ARNm E6 par qPCR et ISH de l’ARN chez les patients HPV-16-positifs avec surexpression de p16
L’expression de l’ARNm E6 a été détectée dans des échantillons provenant de patients identifiés comme HPV-16-positifs avec surexpression de p16. L’ARN total a été extrait de tissus congelés à l’aide de RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Japon) conformément aux instructions du fabricant. L’ARN total (500 ng) a été utilisé pour synthétiser l’ADNc du premier brin à l’aide d’un kit de réactifs RT PrimeScript™ avec gDNA Eraser (Perfect Real Time ; Takara Bio) conformément aux instructions du fabricant. Pour mesurer l’expression de l’ARNm du HPV-16 E6, une qPCR a été réalisée à l’aide du système de détection CFX96 Touch™ Real-Time PCR (Bio-Rad, Hercules, CA) et du TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Des amorces et des sondes TaqMan (tableau 1) ciblant le gène E6 du HPV-16 et le gène de la β-actine ont été utilisées. La sonde de β-actine a été marquée au FAM à l’extrémité 5′ et au TAMRA à l’extrémité 3′ (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japon). Les conditions d’amplification étaient les suivantes : 2 min à 50 °C, 10 min à 95 °C, et un cycle en deux étapes de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 60 s pour un total de 40 cycles. Deux courbes standard ont été générées pour les gènes E6 et β-actine par amplification de dilutions sérielles de 10 fois (101, 102, 103, 104, 105 et 106 copies) du plasmide précoce pB-actine et du plasmide pCAG-mGFP-actine, cadeau de Ryohei Yasuda, portant la région codante complète de la β-actine (Addgene plasmid # 21948 ; Addgene). L’expression du gène E6 dans chaque échantillon a été normalisée par la quantité du contrôle interne β-actine.
L’ISH de l’ARN pour l’ARNm du HPV-16/- 18 E6/E7 a été réalisée à l’aide d’un kit de réactifs RNAscope® 2.5 HD (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) conformément aux instructions du fabricant. En bref, des sections sérielles de 4μm d’épaisseur d’échantillons FFPE ont été déparaffinées au xylène et réhydratées à l’aide d’une série d’alcools gradués. La peroxydase endogène a été bloquée avec le réactif au peroxyde d’hydrogène RNAscope® à température ambiante pendant 10 minutes. La récupération de l’ARN du HPV cible a été réalisée dans le réactif de récupération de cible RNAscope® à 100 °C pendant 15 min. Les lames ont été digérées avec RNAscope® Protease Plus à 40 °C pendant 30 min. La sonde d’ARN HPV-16/- 18 E6/E7 (RNAscope® Probe-HPV16/18) a été ajoutée aux sections et une lamelle a été appliquée. Les lames ont été transférées dans une chambre humidifiée pour une hybridation à 40 °C pendant 2 h. Ensuite, les lamelles ont été retirées et les lames ont été lavées avec le réactif RNAscope® Wash Buffer à 40 °C. L’amplification du signal a été réalisée selon les instructions du fabricant. La détection de la sonde hybridée a été réalisée à l’aide de 3,3′-diaminobenzidine (kit de réactifs RNAscope® 2.5 HD). Les lames ont été contre-colorées avec de l’hématoxyline. Des lames témoins positives (cellules HeLa exprimant l’ARNm du HPV-18 E6/E7) ont été incluses dans l’ISH de l’ARN. La coloration positive a été identifiée comme des points ponctués bruns observés dans le noyau et/ou le cytoplasme.
Analyse statistique
Le test du chi-carré de Pearson a été utilisé pour comparer les caractéristiques des patients LC en fonction de l’ADN HPV et du statut de surexpression de p16. La survie cumulée (SC) a été calculée à l’aide de la méthode Kaplan-Meier et a été comparée entre deux groupes à l’aide du test log-rank. Toutes les analyses ont été effectuées avec le progiciel statistique SPSS (SPSS, version 25.0 ; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). P < 0,05 a été considéré comme significatif.