Le test de migration transwell est une technique classique qui permet aux scientifiques de quantifier le mouvement des cellules. La migration fait référence à la capacité d’une cellule à se déplacer individuellement ou en grappes. Les mouvements cellulaires sont rendus possibles par une restructuration précise de leur cytosquelette et la migration se produit généralement en réponse à des stimuli qui agissent comme des signaux.
Aujourd’hui, nous discuterons du test de migration transwell, qui utilise une configuration de chambre simple pour évaluer la migration en réponse à des signaux d’attraction.
Nous commencerons par fournir quelques informations de base sur la chambre transwell.
L’appareil a été conçu pour la première fois par le Dr Stephen Boyden en 1961, qui l’a utilisé pour étudier la migration des leucocytes. Par conséquent, cette méthode est également connue sous le nom de test de la chambre de Boyden.
Dans une chambre de Boyden simple, la paroi extérieure est des puits, comme ceux d’une plaque à 96 puits. A l’intérieur de chaque puits, un transwell, qui est un insert cylindrique, est placé. L’insert possède une membrane en polycarbonate dont la taille des pores est définie. Lorsqu’il est placé dans le puits, il divise la chambre en deux compartiments. Le compartiment supérieur est celui où seront ensemencées les cellules dont on veut étudier le comportement migratoire, et le réservoir inférieur est celui où est placée la solution de chimioattractant. Par définition, un chimioattractant est une molécule qui a la capacité de favoriser la motilité cellulaire en « attirant les cellules »
Du fait de ces forces attractives, les cellules du compartiment supérieur migrent à travers les pores vers le réservoir inférieur. Si les cellules ont des propriétés adhérentes, comme certaines cellules de mélanome, suite au mouvement elles vont « coller » à la face inférieure de la membrane. Dans ce cas, la membrane peut être fixée, colorée, et les cellules peuvent être comptées au microscope. D’autre part, les cellules non adhérentes, comme les spermatozoïdes, vont migrer dans le réservoir inférieur. Dans ce cas, les cellules dans la solution du réservoir peuvent être comptées à l’aide d’un hémocytomètre.
Bien que la configuration de ce test soit simple, il y a plusieurs choses que vous devez considérer avant l’expérience. Passons en revue certains d’entre eux.
En commençant par la solution d’ensemencement, vous devez vous assurer que la densité est optimisée pour observer la migration des cellules. Trop peu de cellules peuvent entraîner une migration indétectable, et des densités plus importantes surpeupleront la membrane, rendant difficile le dénombrement de la migration. La deuxième considération est la taille des pores de l’insert. Elle doit être choisie avec soin en fonction du type de cellule. Si la taille des pores est trop petite, les cellules seront incapables de passer à travers.
Alternativement, si la taille des pores est trop grande, les cellules vont juste tomber à travers, ce qui n’est pas une migration. Enfin, il faut être attentif à la concentration du chimioattractant et au temps d’incubation à prévoir pour la migration, car ils sont interdépendants. Une concentration optimale avec un temps d’incubation approprié pendant lequel le gradient de concentration est maintenu entre les compartiments, induit une migration cellulaire due à la chimio-attraction. A l’inverse, des incubations prolongées peuvent s’accompagner d’un équilibrage du chimioattractant dans toute la chambre, conduisant à la perte du gradient chimique, ce qui peut confondre l’analyse des résultats obtenus.
Avec ces considérations à l’esprit, discutons d’un protocole utilisé pour mesurer la migration des cellules adhérentes.
Les cellules à doser sont préparées dans un milieu sans protéase, car les protéases peuvent dénaturer d’importants récepteurs membranaires, et finalement affecter la migration. Une fois les cellules préparées, la suspension doit être diluée pour obtenir une densité de semis optimale. Afin de préparer la chambre, les transpuits sont placés dans les puits d’une plaque multipuits. La suspension cellulaire doit être pipetée dans le transwell sans toucher la membrane ni introduire de bulles d’air.
La solution chimioattractante est pipetée dans le réservoir inférieur, en s’assurant que la solution touche la membrane de l’insert. Le temps d’incubation pour la migration dépendra des considérations expérimentales. Après l’incubation, les membranes sont fixées en plongeant l’insert dans de l’éthanol à 70%. Après avoir laissé l’insert sécher, on ajoute une solution de coloration cellulaire.
Puis, les cellules sont incubées pendant environ 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, les inserts sont lavés à l’aide d’un tampon de lavage. Enfin, la membrane peut être excisée et placée sur une lame de microscope. Les cellules sur la face inférieure de la membrane représentent le nombre de cellules qui ont migré en présence et en l’absence de chimioattractants.
Puisque, maintenant, vous avez une idée du protocole, regardons brièvement comment les chercheurs utilisent cette méthode dans leurs explorations.
L’une des applications les plus courantes de ce test est d’évaluer les propriétés chimioattractantes de composés inconnus. Ici, les scientifiques ont voulu examiner les trajectoires de nage des spermatozoïdes de grenouilles en présence d’allurine, qui est une substance sécrétée par les œufs d’amphibiens. Pour ce faire, ils ont d’abord pipeté des spermatozoïdes de grenouille actifs en haut des inserts transwell. Au fond, ils ont ajouté de l’allurine. Après avoir laissé les cellules migrer, ils ont compté les spermatozoïdes dans la solution réservoir sous un microscope. Grâce à cette technique, ils ont pu générer une courbe concentration-réponse décrivant l’effet de la concentration d’allurine sur la migration des spermatozoïdes.
Lorsqu’une cellule est attaquée par des agents pathogènes, elle envoie des chimioattracteurs pour recruter des cellules immunitaires qui migrent, se fixent et résolvent ensuite l’infection. Pour tester ce phénomène, ces scientifiques ont cultivé des cellules épithéliales sur la face inférieure des inserts. Ensuite, ils ont infecté ces cellules avec différentes souches de bactéries. Enfin, ils ont introduit des cellules immunitaires dans la chambre supérieure. On sait que les cellules infectées produisent plusieurs chimioattractants qui induisent la migration des cellules immunitaires. Les résultats de cette expérience ont démontré différents degrés de migration des neutrophiles en réponse à différents types d’infection bactérienne.
Enfin, l’invasion des cellules cancéreuses et les métastases à travers la matrice extracellulaire ont toujours intrigué les biologistes cellulaires. Ici, les scientifiques ont voulu déterminer comment des chimioattractants spécifiques peuvent contribuer à une telle migration à travers une matrice 3D. Ils ont créé par génie génétique deux pools de cellules distincts : l’un exprimant une protéine fluorescente verte et l’autre une protéine fluorescente rouge. Ils ont ensuite pipeté un imitateur de matrice extracellulaire sur le dessus des transwells.
Une fois solidifié, ils ont inversé le transwell et ensemencé deux pools de cellules sur la face inférieure de la membrane. Ensuite, ils ont replacé l’insert dans la plaque multipuits et ont pipeté la solution chimioattractante dans la chambre supérieure. Les cellules situées en bas se sont alors déplacées vers le haut et à travers la matrice 3D. Avec l’aide de l’imagerie confocale, ces chercheurs ont reconstitué la migration cellulaire en 3D et ont distingué les schémas de migration de deux groupes de cellules.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le test de migration transwell. Avec la compréhension des composants et le protocole de cette méthode, vous savez maintenant pourquoi il est si largement utilisé par les biologistes cellulaires. Malgré la simplicité de cette installation, la gamme de configurations que cette méthode peut adapter la rend indispensable pour les études de la motilité cellulaire. Comme toujours, merci d’avoir regardé !