COMMENTAIRE
L’exclusion de colorant est une technique simple et rapide mesurant la viabilité cellulaire mais elle est soumise au problème que la viabilité est déterminée indirectement à partir de l’intégrité de la membrane cellulaire. Ainsi, il est possible que la viabilité d’une cellule ait été compromise (mesurée par la capacité à croître ou à fonctionner) même si l’intégrité de sa membrane est (au moins transitoirement) maintenue. Inversement, l’intégrité de la membrane d’une cellule peut être anormale, mais la cellule peut être capable de se réparer et de devenir totalement viable. Un autre problème potentiel est que, comme l’absorption de colorant est évaluée subjectivement, de petites quantités d’absorption de colorant indiquant une lésion cellulaire peuvent passer inaperçues. À cet égard, l’exclusion de colorant réalisée avec un colorant fluorescent à l’aide d’un microscope à fluorescence entraîne systématiquement le pointage d’un plus grand nombre de cellules non viables avec absorption de colorant que les tests réalisés avec du bleu trypan à l’aide d’un microscope à transmission.
Une méthode plus sophistiquée de mesure de la viabilité cellulaire consiste à déterminer l’exclusion de colorant par cytométrie de flux. Cela peut être fait en utilisant le bleu typan puisque cette protéine se lie aux protéines et émet ensuite un signal de fluorescence qui peut être détecté dans un cytomètre en flux (à 660 nm lorsqu’elle est liée à l’albumine sérique bovine) (Voir la référence 2 pour les détails de l’utilisation du bleu trypan en cytométrie en flux). L’exclusion peut également être mesurée avec d’autres colorants émetteurs de lumière tels que l’iodure de propidium (voir l’unité 5.4 pour une description de l’utilisation de l’iodure de propidium ; évaluation de la viabilité cellulaire par analyse cytométrique en flux). Une comparaison détaillée des estimations des cellules vivantes par rapport aux cellules mortes en utilisant la technique d’exclusion du bleu trypan évaluée manuellement comme décrit ici et évaluée électroniquement par cytométrie en flux indique que les deux techniques fournissent des résultats très similaires dans des mains expérimentées. Alors que la technique d’exclusion de colorant décrite est plus susceptible d’entraîner des erreurs en raison de la subjectivité de l’opérateur, l’approche par cytométrie en flux est moins adaptée à l’évaluation de la viabilité cellulaire pendant l’exécution de techniques de purification cellulaire complexes et longues. Ainsi, une technique de cytométrie de flux n’est applicable que lorsque des mesures précises sur le nombre de cellules mortes dans un mélange de cellules doivent être obtenues.
Récemment, un « test automatisé de viabilité au microscope à fluorescence » a été rapporté dans lequel la viabilité cellulaire utilisant l’iodure de propidium en conjonction avec un dispositif qui compte les cellules vivantes et mortes dans un compteur de cellules de microscope portable équipé d’une puce électronique. Ce compteur est censé pouvoir évaluer la viabilité cellulaire plus rapidement que la technique manuelle décrite ici ou que le cytomètre en flux et obtenir des comptages plus précis et plus fiables. Ce dispositif peut être utile dans les situations où de nombreux tests de viabilité cellulaire acquis rapidement sont nécessaires (3).
Il convient de noter que la viabilité cellulaire peut également être évaluée avec des colorants qui se lient à l’ADN (monoazide d’éthidium), des agents qui se lient à la phosphatidylsérine (Annexin V) et des colorants réactifs aux amines. L’utilisation de ces agents alternatifs nécessite généralement une cytométrie en flux et n’est donc applicable que dans des conditions particulières.
L’exclusion au bleu de Trypan, telle que décrite dans le protocole ci-dessus, peut être réalisée en 5 à 10 min.