Présentation du cas
Le présent rapport de cas est issu d’une visite vétérinaire de routine dans une ferme de 155 animaux, avec deux races de moutons (Pelifolk et Blackbelly), située à Tesistán, municipalité de Zapopan, état de Jalisco, Mexique. Les installations de cette ferme ont été adaptées d’une ancienne ferme porcine, et sont toujours entourées de fermes porcines et bovines dans le voisinage proche. Le troupeau était maintenu sur des sols surélevés pour faciliter le nettoyage et la manipulation, mais de nombreux objets tranchants rôtis (tels que du fil de fer, des clôtures cassées, des clous, etc.) étaient présents dans les enclos et le nettoyage n’était pas effectué correctement dans la ferme au moment de l’inspection. L’alimentation était basée sur des aliments disponibles localement, tels que du fourrage grossier de faible qualité, du lisier de porc et des aliments concentrés commerciaux à haute teneur en protéines. Cette ferme a fait appel aux services vétérinaires en raison de la présence fréquente d’abcès cutanés chez les animaux, aucune autre plainte liée à des problèmes de peau n’ayant été signalée. Les abcès ne semblent pas affecter la productivité des animaux, cependant la présence de telles lésions affecte négativement la commercialisation des animaux, et par conséquent, le propriétaire était intéressé à connaître l’agent étiologique et le traitement recommandé pour éliminer la maladie de la ferme. Le contenu des abcès a été prélevé sur 31 animaux (29 brebis, 1 bélier et 1 agneau) par un vétérinaire certifié et envoyé au laboratoire pour un diagnostic bactériologique, afin de trouver les agents étiologiques à l’origine du problème. Sur la base de l’aspect des abcès, le diagnostic présumé de l’infection dans l’élevage était la lymphadénite caséeuse pour la plupart des animaux . Cependant, l’analyse bactériologique a démontré que 13 animaux étaient infectés par C. pseudotuberculosis, 1 par Corynebacterium spp, 2 par Proteus spp, 2 par Streptococcus spp, et dans les 13 autres cas, l’agent pathogène n’a pu être identifié. La catégorisation de l’isolat de Corynebacterium spp. n’était pas claire car les résultats des tests bactériologiques et biochimiques n’étaient pas concluants.
Cet article décrit l’isolement de C. xerosis d’un agneau Pelifolk (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) de 4 mois en bon état corporel. A notre connaissance, il s’agit du premier rapport sur C. xerosis produisant un abcès cutané clinique chez le mouton. Le propriétaire de l’animal a donné son consentement éclairé pour la publication des résultats de l’étude clinique, y compris le matériel photographique. L’animal présentait un abcès de consistance dure, sans drainage, sur le côté gauche du cou (Fig. 1a). Le diagnostic clinique initial a suggéré une lymphadénite caséeuse, probablement causée par C.pseudotuberculosis. Un échantillon pour analyse bactériologique a été obtenu en ponctionnant l’abcès avec une seringue stérile de 5 ml, avec une aiguille hypodermique de calibre 20 après avoir nettoyé et désinfecté la surface de l’abcès. Le type d’exsudat récupéré était de type séreux et d’aspect blanc. L’échantillon biologique a été conservé à 4 °C jusqu’à sa caractérisation biologique au Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, km 15,5 route Toluca-Atlacomulco, Toluca, Mexique, z.c. 50200). Le délai entre l’échantillonnage et le traitement n’a pas dépassé 72 h. L’échantillon a été cultivé en double, dans de la gélose au sang de mouton à 8 % et incubé de 24 à 48 h à 37 °C dans des conditions aérobies et microaérophiles. Des colonies de 1,0 mm de diamètre, non hémolytiques, de couleur brun jaunâtre et d’aspect légèrement sec ont été observées (Fig. 2a). Ces caractéristiques morphologiques ne correspondaient pas à celles décrites précédemment pour C. pseudotuberculosis, mais elles ressemblaient plutôt à des colonies de C. xerosis . Au microscope (grossissement 10× ; Fig. 2c), les bactéries ont été observées comme des bâtonnets Gram-positifs pléomorphes, à extrémités en forme de massue et irrégulièrement colorés. Les tests biochimiques ont donné les résultats suivants : Fer triple sucre (TSI,-), Gélose au fer lysine (LIA,-), Test au citrate (CIT,-), Sulfure Indole-Motilité (SIM,-), Motilité, Indole, Ornitine (MIO,-), Oxydatif-fermentaire (OF,-) Rouge de méthyle (-), Eau peptonée (-), Voger Pascaguer (-), Urée (-), Bouillon nitrate (+), Tréhalose (+), Sucrose (+), Maltose (+) et Fermentation du glucose (positive à 37 °C et négative à 42 °C). Ces résultats pourraient correspondre à un profil de C. pseudotuberculosis, à l’exception du test d’urée, qui était négatif au lieu d’être positif, et qui coïncide donc mieux avec un profil de C. xerosis . Les résultats diagnostiques n’étaient pas concluants, donc, même si le système API n’est pas spécifique pour identifier C. xerosis, nous avons décidé d’étudier l’isolat avec ce système, pour voir si cet isolat pouvait être identifié comme d’autres espèces de Corynebacterium. De plus, afin de savoir si cet isolat appartient à d’autres espèces telles que C. freneyi et C. amycolatum qui peuvent rarement être trouvées chez les moutons, nous avons testé si la colonie était capable de se développer à 20 °C et si elle était capable de fermenter le glucose à 42 °C. L’isolat a bien poussé à 20 °C et n’a pas fermenté le glucose à 42 °C, deux caractéristiques associées à C. xerosis et C. hansenii, nous avons donc décidé d’effectuer une analyse moléculaire pour savoir si nous pouvions identifier moléculairement l’isolat comme étant C. xerosis. Nous avons analysé trois loci pour augmenter la précision de notre diagnostic. Nous avons testé un gène normalement absent chez C. xerosis mais présent chez C. pseudotuberculosis, le gène pld où nous nous attendions à ne pas trouver d’amplicon après le test PCR si l’isolat était C. xerosis, contrairement à C. pseudotuberculosis qui amplifiera une bande de 203 pb ; un deuxième locus visait l’amplification de la région intergénique des gènes de l’ARNr 16S-23S (16S-23S) en utilisant des amorces conçues pour C. pseudotuberculosis, qui ont été rapportées comme ne fonctionnant pas pour C. xerosis, et nous nous attendions également à ne pas trouver de bande d’amplification pour C. xerosis et une bande de 816 pb pour C. pseudotuberculosis. Enfin, nous avons procédé à l’amplification par PCR et au séquençage du gène rpoB (446 pb), qui a déjà été signalé pour différencier les espèces de Corynebacterium. L’extraction de l’ADN a été réalisée à l’aide d’un kit commercial (KAPA Express Extract) en suivant le protocole du fabricant. Une technique de Multiplex-PCR pour l’amplification des séquences partielles des gènes pld, 16S-23S et rpoB a été réalisée en utilisant le protocole publié par Pacheco en 2007 . Les réactions ont été effectuées en utilisant un kit commercial de PCR multiplex (QIAGEN Multiplex PCR) en suivant les spécifications du fabricant. L’analyse PCR a porté sur les échantillons suivants : L’isolat à caractériser, l’isolat putatif de C. xerosis, et deux C. pseudotuberculosis (un isolat local précédemment caractérisé comme biovar ovis et, une souche de référence, ATCC 43924, biovar equi) utilisés comme témoins. Comme prévu pour le C. xerosis putatif, une seule bande d’amplicon PCR de 446 bp, correspondant au fragment du gène rpoB a été amplifiée, et les fragments intergéniques du gène 16S-23S et du gène pld n’ont pas été amplifiés. Comme prévu, les deux souches de C. pseudotuberculosis ont présenté trois bandes de 203, 446 et 816 pb, correspondant aux gènes pld, rpoB et 16S, respectivement (Fig. 3). Les amplicons du gène rpoB des trois échantillons ont été purifiés à l’aide du kit de purification Promega (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) et ont été envoyés pour un séquençage automatique par Macrogen (Rockville, MD, USA). Les alignements de séquences multiples obtenus à partir d’un BLAST (NCBI) ont été analysés avec les séquences de nos isolats en utilisant l’analyse Clustal W de Mega 6.0.6 (Fig. 4). L’analyse phylogénétique a été réalisée en utilisant la méthode de voisinage (logiciel MEGA 6.0.6). Les valeurs Bootstrap ont été obtenues en générant 1000 arbres aléatoires. L’analyse phylogénétique a également inclus les séquences du gène rpoB de C. xerosis (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculosis biovar ovis (GenBank CP002924.1) et C. pseudotuberculosis biovar equi (GenBank CP003540.2). Il a été possible d’observer différents groupes phylogénétiques qui correspondaient à des espèces particulières de Corynebacterium. Ces résultats, confirment que l’isolat de cette étude (rpoB C53) est C. xerosis (Fig. 4).
Abcès étudié. Un abcès de consistance dure sans drainage a été signalé dans la région du cou d’un agneau de 4 mois
Culture bactériologique in-vitro de Corynebacterium xerosis et Corynebacterium pseudotuberculosis. Les bactéries ont été cultivées dans une gélose au sang de mouton à 8 %. aCorynebacterium pseudotuberculosis (ATCC 43924) a présenté des colonies blanchâtres avec une hémolyse bêta. bL’isolat de Corynebacterium xerosis, s’est développé sous forme de petites colonies brun jaunâtre sans hémolyse. c Préparation de frottis à coloration de Gram de Corynebacterium xerosis montrant des bâtonnets Gram-positifs pléomorphes caractéristiques, avec des extrémités en forme de massue
Multiplex PCR. Amplification de séquences partielles des gènes 16S rRNA, rpoB et pld. Couloir MW : marqueur de poids moléculaire de 1 Kb Plus DNA Ladder™ (Invitrogen). Couloir 1 : contrôle négatif (réaction sans ADN matrice). Couloir 2 : Corynebacterium pseudotuberculosis biovar equi. Couloirs 3-4 : isolat de Corynebacterium xerosis (10-0.001 ng d’ADN, respectivement). Couloir 5 : Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis
Analyse bioinformatique. a Montre l’alignement de séquence des séquences utilisées pour construire l’arbre phylogénétique en (b). Trois séquences ont été téléchargées de GenBank : C. pseudotuberculosis biovar ovis (CP002924.1), C. pseudotuberculosis biovar equi (CP003540.2), et Corynebacterium xerosis (AY492233.1). Les trois autres étaient des spécimens envoyés pour le séquençage (Macrogen, Rockville, MD, USA) : rpoB13 (isolat local caractérisé comme C. pseudotuberculosis, biovar ovis), rpoB C1 (C. pseudotuberculosis, biovar equi, souche de référence ATCC43924) et rpoB C53 (isolat local, caractérisé comme étant C. xerosis). b L’arbre montre la relation génétique de Corynebacterium pseudotuberculosis et Corynebcaterium xerosis pour le gène rpoB. L’arbre a été construit à partir de l’alignement de la séquence partielle du gène. Les valeurs Bootstrap ont été obtenues en générant 1000 arbres aléatoires, et la force de chaque branche est indiquée dans le nœud respectif
Les techniques de génotypage telles que la PCR ainsi que l’analyse de séquence de l’isolat rpoB C53 dans cette étude ont grandement contribué à une identification correcte de l’espèce, qui était à l’origine trompeuse en utilisant les caractéristiques phénotypiques microscopiques et biochimiques. Corynebacterium xerosis a été précédemment rapporté dans des échantillons cliniques de cas humains dans des lésions d’endocardite, de pneumonie, d’ostéomyélite et d’infections cutanées, en particulier chez les patients immunodéprimés . Il a également été trouvé dans des échantillons cliniques d’animaux, par exemple, dans des lésions du foie de chèvres (suspicion de pseudotuberculose), et dans du lait de vache, provenant d’animaux présentant une mastite. Chez le porc, C. xerosis a été isolé dans des lésions de différents tissus tels que le foie, les reins, les poumons, la rate, les articulations, ainsi que dans des abcès sous-cutanés. De plus, C. xerosis a été isolé à partir d’échantillons cliniques d’utérus d’ovins, dans un cas d’avortement, et à partir de tissus pulmonaires d’animaux présentant des problèmes respiratoires. Ces isolats ont été identifiés et caractérisés par amplification du gène 16S-23S de l’ARNr par PCR-RFLP. Cependant, dans ces études, il n’a pas été possible d’obtenir un motif de bandes suffisamment clair pour différencier C. xerosis des autres espèces de Corynebacterium. Les auteurs ont également effectué une analyse et une comparaison de séquence des gènes 16S et rpoB, ce qui leur a permis de différencier C. xerosis d’autres espèces, génétiquement similaires à Corynebacterium .
Comme mentionné ci-dessus, cette étude a été menée sur la base de la présence du gène rpoB, qui a été rapporté par d’autres auteurs comme le gène de choix pour l’analyse phylogénétique du genre Corynebacterium, car il présente un polymorphisme élevé, encore plus important que la région espaceur intergénique des gènes 16S-23S rRNA . On sait que les abcès cutanés du mouton (lymphadénite caséeuse) sont causés par C. pseudotuberculosis et que son principal facteur de virulence et de pathogénicité est l’exotoxine phospholipase D, codée par le gène pld et exprimée dans la membrane cellulaire de la bactérie . Cette exotoxine est un facteur de perméabilité qui favorise l’hydrolyse des liaisons ester de la sphingomyéline dans les membranes cellulaires des mammifères, contribuant probablement à la dissémination des bactéries du site initial de l’infection aux sites secondaires par le système lymphatique jusqu’aux ganglions régionaux, et elle semble être impliquée dans la réduction de la viabilité des macrophages après l’infection . L’exotoxine provoque également des lésions dermonécrotiques. Cependant, cette exotoxine n’a pas été signalée chez C. xerosis comme une toxine pathogène qui pourrait contribuer au développement d’abcès. Cela souligne l’importance de mener des recherches supplémentaires concernant les mécanismes d’infection présents dans cette espèce de Corynebacterium.
Un point majeur de discussion de nature épidémiologique, comprend le fait que le système de production ovine, où l’échantillon a été obtenu, a été précédemment utilisé pour les porcs, une espèce où C. xerosis a été signalé comme un pathogène commun . De plus, l’un des principaux ingrédients du régime alimentaire des moutons comprend des sous-produits de porc (lisier de porc), qui pourraient éventuellement contenir des agents pathogènes actifs, dont Corynebacterium spp. En outre, des objets tranchants tels que des tiges, des clous et des fils métalliques sont répandus dans les installations, ce qui augmente le risque de blessure des animaux, ouvrant ainsi une voie d’entrée à Corynebacterium spp. dans l’organisme, y compris C. xerosis. Tous ces facteurs peuvent avoir contribué à la présence de C. xerosis dans l’établissement. Aucune autre étude n’a été menée, mais il a été recommandé au propriétaire de débrider et de désinfecter les abcès de tous les animaux, dans une zone exempte d’infection (pour éviter la propagation des agents pathogènes), de renforcer le nettoyage des enclos et d’éliminer tous les bords et objets tranchants des clôtures, des mangeoires et des sols. Étant donné que C. xerosis, ainsi que C. pseudotuberculosis, sont des micro-organismes potentiellement zoonotiques, des recommandations ont été faites à l’éleveur pour qu’il prenne des précautions extrêmes lors de la manipulation des animaux et des déchets produits par la ferme afin de prévenir l’infection humaine et animale et la possible propagation du micro-organisme à d’autres fermes.