Sensibilité antimicrobienne in vitro de Aerococcus urinae à 14 antibiotiques, et courbes time-kill pour la pénicilline, la gentamicine et la vancomycine

Abstract

Aerococcus urinae est un nouveau venu dans la pratique clinique et microbiologique, causant des infections des voies urinaires, des bactériémies/septicémies et/ou des endocardites. Cette étude présente pour la première fois une évaluation de l’activité d’un panel représentatif d’antibiotiques contre un grand nombre d’isolats d’A. urinae. Les sensibilités in vitro (CMI) de 56 isolats d’A. urinae à 14 antibiotiques ont été déterminées par dilution en gélose. En général, les isolats d’A. urinae présentaient une faible variabilité inter-isolats, et avaient des CMI faibles pour la pénicilline, l’amoxicilline, la pipéracilline, le céfépime, la vancomycine et la rifampicine. Aucun des isolats n’a présenté de résistance élevée aux aminoglycosides. Une activité modérée à bonne a été observée avec les quinolones, l’érythromycine et la tétracycline. Des isolats provenant de deux patients atteints d’endocardite ont été étudiés avec des courbes time-kill pour la pénicilline, la gentamicine et la vancomycine. La pénicilline et la vancomycine seules ont présenté une activité bactéricide lente ou nulle contre les deux souches. En combinant la pénicilline ou la vancomycine avec la gentamicine, une activité bactéricide rapide a été obtenue pour les deux souches avec les deux combinaisons. Les options de traitement pour A. urinae semblent inclure les pénicillines pour les cas moins sévères. Dans les cas graves, c’est-à-dire les endocardites, les études de time-kill suggèrent un effet bénéfique de l’association avec la gentamicine. Chez le patient allergique à la pénicilline, la vancomycine en combinaison avec la gentamicine représente l’alternative la plus évidente.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, la pertinence clinique de divers cocci Gram-positifs catalase-négatifs a reçu beaucoup d’attention1. Parmi ceux-ci, Aerococcus urinae est un nouveau venu dans la pratique clinique et microbiologique, signalé pour la première fois en 19892 et désigné en 19923. urinae ont été reconnus à l’origine par leur morphologie cellulaire (semblable à celle des staphylocoques dans la coloration de Gram) et leurs caractéristiques de croissance (ressemblant aux streptocoques α-hémolytiques sur la gélose au sang), une réaction négative à la catalase et un antibiogramme très constant démontrant une sensibilité à la pénicilline et une résistance aux sulfamides et aux aminoglycosides.2-4 Dans deux rapports, des souches d’A. urinae ont été isolées à partir de 0,4 à 0,8 % des échantillons d’urine examinés.2,5 La plupart des patients chez qui A. urinae a été isolé étaient des personnes âgées présentant des conditions prédisposantes et des signes d’infection urinaire.2,4,5 Des souches provoquant des infections urinaires ont été reconnues au Danemark, en Suède, aux Pays-Bas, en France, aux Etats-Unis, au Canada et dans des pays d’Amérique du Sud.6A. urinae a également été isolé dans le sang de patients souffrant de bactériémie/septicémie urogène avec ou sans endocardite.7-Une enquête nationale menée au Danemark de 1987 à 1995 a permis d’identifier 26 patients atteints d’A. urinae isolée du sang,6 ce qui correspond à 0,5 patient/an/1 million d’habitants, et à 0,8 % des épisodes d’endocardite infectieuse.8 Les épisodes de bactériémie/septicémie ont bien répondu au traitement par β-lactamines seules ou en association avec un aminoglyco-side, sauf si la bactériémie se compliquait d’une endocardite, auquel cas cinq des six patients sont décédés. Chez un patient, A. urinae a pu, à l’autopsie, être cultivé à partir des valves, malgré un traitement antibiotique apparemment pertinent. Par conséquent, le traitement optimal de l’endocardite à A. urinae doit être déterminé.

L’analyse des isolats d’A. urinae par des méthodes de diffusion par tablettes/disques a révélé une sensibilité à une large gamme d’agents antimicrobiens, y compris les β-lactamines et les non-β-lactamines.5,6,12 Comme les isolats d’A. urinae ont été principalement associés à des infections des voies urinaires, il convient de noter que les souches se sont révélées résistantes aux sulfamides et à d’autres antimicrobiens utilisés pour traiter les infections des voies urinaires, notamment le cotrimoxazole, le triméthoprime, l’acide nalidixique et les polymyxines.2,5,6,12 Récemment, la sensibilité de deux isolats d’A. urinae provenant de patients souffrant d’endocardite a été étudiée en déterminant les CMI de sept antibiotiques, et des courbes time-kill pour la pénicilline en association avec la gentamicine ou la nétilmicine ont été réalisées.11 La présente étude caractérise davantage le profil de sensibilité de 56 isolats d’A. urinae de diverses origines géographiques. Les CMI de 14 antibiotiques ont été déterminées, et pour deux isolats, des expériences de courbe time-kill avec la pénicilline, la gentamicine et la vancomycine, seules ou en combinaison, ont été réalisées afin d’obtenir plus d’informations sur les régimes de traitement optimaux des infections graves causées par A. urinae.

Matériels et méthodes

Souches

Cinquante-six isolats cliniques d’A. urinae ont été étudiés, comprenant 42 isolats danois (17 isolats sanguins et 25 isolats urinaires) et 14 isolats urinaires non danois : un des Pays-Bas (aimablement fourni par P. J. G. M. Rietra), quatre de Suède (aimablement fourni par E. Falsen, Culture Collection, Université de Göteborg) et sept isolats nord-américains (aimablement fournis par R. R. Facklam, The Streptococcus Laboratory, CDC, Atlanta, GA, USA). Les souches de référence suivantes ont été utilisées : Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATTC 25922 et Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Agents antimicrobiens

Les agents antimicrobiens suivants ont été utilisés : benzylpénicilline (Leo, Ballerup, Danemark) ; céfépime (Bristol-Myers Squibb, Wallingford, CT, USA) ; amoxicilline, ceftriaxone, érythromycine, amikacine, gentamicine, nétilmicine, rifampicine, vancomycine (Sigma, St Louis, MO, USA) ; oxytétracycline (Rosco, Taastrup, Danemark), pipéracilline (Lederle, Pearl River, NY, USA), ciprofloxacine (Bayer, Leverkusen, Allemagne) ; et sparfloxacine (Rhône Poulenc Rorer, Vitry, France).

Détermination des CMI

En raison de la croissance fastidieuse d’A. urinae, les conditions d’essai ont dû être modifiées par rapport aux recommandations standard afin de réaliser les déterminations des CMI (c’est-à-dire supplémentation de la gélose en sang à 5% et incubation dans une atmosphère de CO2 à 5% pendant 48 h).13-15 Les CMI ont été déterminées par la méthode de dilution sur gélose. Des dilutions sérielles doubles d’agents antimicrobiens ont été préparées dans de la gélose Mueller-Hinton (Difco Laboratories GmbH, Augsbourg, Allemagne) supplémentée avec 5 % de sang de cheval lysé. Les antibiotiques ont été testés de 0,008 à 512 mg/L, sauf l’amoxicilline (0,032-256 mg/L), la rifampicine (0,008-32 mg/L) et l’oxytétracycline (0,008-2 mg/L). Les inocula de 107 cfu/mL (104 cfu/spot) ont été préparés à partir de cultures gélosées d’une nuit et suspendus dans du NaCl à 0,9 %, et ont été appliqués avec un inoculateur multiple à 21 points (Denley Instruments Ltd, Billinghurst, UK). Les résultats ont été lus après une incubation de 2 jours à 37°C dans 5% de CO2. La CMI a été lue comme la concentration la plus faible montrant la croissance d’un maximum de trois colonies.

Enquêtes sur la courbe time-kill

Deux des isolats sanguins testés (B1 et B8), provenant tous deux de patients atteints d’endocardite, ont été étudiés. Les souches ont été testées contre la pénicilline (CMI 0,125 et 0,6 mg/L, respectivement), la gentamicine (CMI 256 et 64 mg/L, respectivement), et la vancomycine (CMI 0.5 et 1 mg/L, respectivement) aux concentrations cliniques suivantes : pénicilline 2 × et 10 × CMI (P2 et P10, respectivement) ; vancomycine 4 × et 10 × CMI (V4 et V10, respectivement) ; gentamicine 10 mg/L (G10) ; et les associations pénicilline + gentamicine et vancomycine + gentamicine aux concentrations suivantes : P2G10, P10G10, V4G10 et V10G10, respectivement. À t = -1 h, les colonies fraîches cultivées pendant la nuit ont été mises en suspension à environ 105 cfu/mL dans des tubes contenant du bouillon Todd-Hewitt préchauffé. Les tubes ont été placés dans un bain-marie à 37°C. À t = 0 h, des antibiotiques, préparés immédiatement avant le test, ont été ajoutés aux tubes en double. Trois tubes sans antibiotiques ont été utilisés comme contrôle de croissance. Des échantillons en double ont été prélevés à 0, 3, 6 et 24 h dans chaque tube. Les échantillons ont été dilués en série et ensemencés. Le nombre de colonies survivantes a été compté après une nuit d’incubation à 37°C à l’air ambiant dans des sacs en plastique avec du papier de soie humide. En utilisant des échantillons de 20 μL, le nombre minimal de bactéries dénombrables était de 50 cfu/mL. L’effet de report a été éliminé pour les expériences pénicilline-gentamicine en ajoutant 100 μL de pénicillinase 100 000 U/mL à chaque plaque. Pour les expériences vancomycine-gentamicine, l’effet de transfert a été éliminé par dilution. Une étude pilote a démontré un effet de transfert dans l’échantillon 100 mais pas dans l’échantillon 10-1, les cfu ont donc été comptés en utilisant 200 μL des échantillons 10-1, ce qui donne toujours une limite de détection de 50 cfu/mL. Toutes les expériences ont été réalisées au moins deux fois à des jours différents. L’activité bactéricide a été définie comme une réduction de l’inoculum d’au moins 99,9 % en 24 h. La synergie (S), l’effet additif (A) et l’antagonisme ont été définis comme suit : >2 log de destruction en plus (S), >1 et <2 log de destruction en plus (A) et >2 log de destruction en moins, respectivement, pour la combinaison par rapport au meilleur des antibiotiques individuels.

Résultats

Détermination des CMI

Les CMI obtenues pour les 56 isolats sont présentées dans le tableau. En utilisant les points de rupture pour les streptocoques recommandés par le NCCLS14,15 ou par le Swedish Reference Group of Antibiotics (SRGA)16,17, les isolats étaient sensibles aux pénicillines, alors qu’une sensibilité réduite a été trouvée pour les céphalosporines testées. Les CMI des aminoglycosides ont indiqué une sensibilité réduite pour presque tous les isolats. Cependant, aucune résistance élevée aux aminoglycosides (c’est-à-dire gentamicine > 1000 mg/L) n’a été trouvée pour aucun des isolats. Tous les isolats étaient sensibles à la vancomycine. La rifampicine a été le médicament le plus actif testé avec une CMI50 de 0,031 mg/L (intervalle <0,004-0,064 mg/L), sauf pour un isolat avec une CMI > 32 mg/L (tests répétés). Les activités des quinolones ciprofloxacine et sparfloxacine se sont révélées aussi bonnes.

Examens des courbes de destruction

Les courbes de temps de destruction moyennes pour chaque expérience sont présentées dans la figure. La vancomycine seule (à la fois 4 × et 10 × la CMI) a présenté une activité bactéricide contre la souche B1. Pour la pénicilline, l’activité bactéricide a été trouvée seulement pour 10 × CMI contre B8. Pour les deux antibiotiques, l’effet bactéricide a été lent, c’est-à-dire qu’il est apparu pour la première fois après 24 h. La gentamicine n’a pas été bactéricide – dans la plupart des expériences, une croissance a été observée. La pénicilline en combinaison avec la gentamicine a été synergique et a été rapidement bactéricide pour la souche B8 à la fois dans P2G10 et P10G10. Pour la souche B1, cependant, seul un effet bactéricide additif et lent a été trouvé. En associant la vancomycine à la gentamicine, un effet bactéricide rapide a été trouvé pour les deux souches. Un effet synergique était détectable après 3 h et 6 h pour la souche B8. Cependant, à 24 heures, l’activité meurtrière de la vancomycine était si prononcée qu’il n’a pas été possible de détecter un effet synergique. Pour la souche B1, seul un effet additif a été constaté. Aucun effet antagoniste n’a été enregistré dans aucune des expériences.

Discussion

Cette étude présente pour la première fois une évaluation des CMI d’un panel représentatif d’antibiotiques contre un grand nombre d’isolats d’A. urinae obtenus à partir de patients présentant une infection des voies urinaires, une bactériémie/septicémie et/ou une endocardite. Afin d’évaluer l’utilisation des antibiogrammes à des fins taxonomiques, les CMI de 15 antibiotiques pour 10 souches d’A. urinae ont été examinées précédemment,12 mais les données détaillées n’ont pas été présentées.

A. urinae sont des organismes fastidieux qui nécessitent un apport de sang dans les milieux et parfois une incubation dans une atmosphère enrichie en CO2 et/ou une période d’incubation prolongée afin d’obtenir une croissance suffisante pour tester la sensibilité aux antibiotiques. Par conséquent, les souches n’ont pas pu être testées dans les conditions standard décrites par la BSAC ou le NCCLS.13-15 La nécessité de modifier les conditions de culture est cependant un problème courant pour les bactéries Grampositives fastidieuses.18,19 Les isolats de A. urinae ont présenté un profil de sensibilité aux antimicrobiens similaire à celui des streptocoques α-hémolytiques avec seulement de petites variations de sensibilité inter-isolées. Les CMI des β-lactamines pour les isolats se situaient typiquement à l’intérieur de quatre étapes de dilution double, sauf pour les céphalosporines ceftriaxone et céfépime, qui ont montré une plus grande variation de CMI (Tableau). En raison de l’influence possible de l’incubation au CO2 (baisse du pH), il convient d’être prudent dans l’évaluation de la sensibilité à la tétracycline (sensibilité surestimée) et à l’érythromycine (sensibilité sous-estimée). Parmi les isolats d’A. urinae examinés, aucune résistance de haut niveau n’a été identifiée contre les aminoglycosides testés, laissant ouverte la possibilité d’un effet synergique lorsqu’ils sont associés à une β-lactamine ou à la vancomycine (vide infra). D’après les CMI, il existe plusieurs alternatives de traitement pour les infections graves puisque les isolats étaient sensibles aux pénicillines, à la vancomycine et à la rifampicine (sauf un isolat). Les quinolones sélectionnées, la ciprofloxacine et la sparfloxacine, ont également montré une bonne activité. Bien qu’il s’agisse d’un organisme fastidieux, les résultats obtenus par les méthodes de diffusion de disques2,5,20 ont été conformes aux CMI présentées dans cette étude, ce qui suggère qu’un résultat fiable peut être obtenu en utilisant ces méthodes de sensibilité de routine.

Les directives pour le traitement des infections graves telles que la septicémie avec ou sans endocardite devraient de manière optimale être basées sur l’expérience clinique dans des études soigneusement conçues, mais cela est difficile lorsqu’il s’agit de bactéries rares. Par conséquent, les études in vitro, y compris les techniques de courbes de survie, peuvent fournir des informations importantes pour le clinicien dans ces cas.

Des concentrations antibiotiques réalisables in vivo ont été choisies pour les expériences. Pour la gentamicine, une dose de 10 mg/L a été choisie, ce qui correspond à la concentration obtenue par une dose quotidienne unique de 240 mg (équivalent à 3-4 mg/kg).21 De plus, bien que plusieurs articles préconisent une dose biquotidienne pour l’endocardite, au Danemark, une dose quotidienne unique de gentamicine est couramment utilisée, en raison de la réduction de la néphrotoxicité et du fait que l’effet synergique avec les β-lactamines augmente avec les concentrations d’aminoglycosides.22 Les données obtenues dans notre étude in vitro des courbes de destruction de la pénicilline et de la vancomycine ont montré que ni la pénicilline ni la vancomycine n’étaient bactéricides contre l’un ou l’autre des deux isolats testés provenant de patients atteints d’endocardite infectieuse. En association avec la gentamicine, un effet bactéricide a été obtenu contre les deux isolats, tant pour la pénicilline que pour la vancomycine. Heureusement, ces schémas thérapeutiques sont recommandés pour le traitement de l’endocardite infectieuse d’étiologie inconnue dans le monde entier.23 Les taux de destruction des deux souches étaient différents, ce qui indique qu’il peut exister des variations entre les souches. Malgré la sensibilité in vitro aux antibiotiques administrés, nous avons constaté que le pronostic était mauvais pour les patients âgés souffrant d’une endocardite infectieuse causée par A. urinae.8 Les présents résultats pour la pénicilline, la gentamicine et la nétilmicine (CMI) sont conformes à ceux du récent rapport suisse de Zbinden et al.11 pour deux isolats d’A. urinae provenant de patients atteints d’endocardite.

Les options thérapeutiques pour A. urinae semblent inclure les pénicillines pour les cas moins sévères. Dans les cas sévères, c’est-à-dire les endocardites, les enquêtes time-kill suggèrent un bénéfice de l’association pénicilline ou vancomycine avec la gentamicine. Chez le patient allergique à la pénicilline, la vancomycine représente l’alternative la plus évidente.

Tableau.

MICs de 14 agents antimicrobiens der A. urinae (n = 56)

La limite supérieure de sensibilité pour les streptocoques selon le NCCLS15 ou par SRGA16,17 marquée par un ombrage gris.

aNombre de souches.

bMIC *< 0,032 mg/L.

cMIC > 32 mg/L.

dMIC > 2 mg/L

Tableau.

MICs de 14 agents antimicrobiens der A. urinae (n = 56)

La limite supérieure de sensibilité pour les streptocoques selon le NCCLS15 ou par SRGA16,17 marquée par un ombrage gris.

aNombre de souches.

bMIC *< 0,032 mg/L.

cMIC > 32 mg/L.

dMIC > 2 mg/L

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